趙秀玲,吳迪迪,朱啟杭
(黃山學院生命與環境科學學院,安徽黃山,245021)
荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaert的干燥葉,在我國廣泛分布于湖南、湖北、浙江、江蘇等地。該藥材味苦澀,性平。具有清暑化濕,升發清陽,涼血止血等功能,屬藥、食兩用植物[1]。荷葉中的功能性成分含量為30.5%[2],主要含有生物堿、黃酮、揮發油等成分,其中黃酮如金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、N ympholide A,N ympholide B和 M yzricetin-3-(6-P-coumaroy)-glucoside[3]等 15 種之多物質,這些物質能夠改變機體對變能反應原、病毒及致癌物反應的能力,并保護機體組織不受氧化性侵襲的傷害,因此具有“天然生物反應調節劑”的美稱;生物堿有荷葉堿、N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿、牛心果堿、亞美帕堿、原荷葉堿[4]等,是荷葉中主要的降脂活性組分。而且處于不同生長期的荷葉中所含的總黃酮和荷葉堿含量存在一定差異,隨著荷葉生長二者含量逐漸增加,至成熟期時,二者含量達最高峰值分別為84.21 mg/g和2.132 mg/g;當荷葉進入衰亡期時,二者含量又逐漸下降[5]。此外荷葉中還含有β-胡蘿卜素、VC、皂類、甾體、酒石酸、枸櫞酸、蘋果酸、草酸等。
黃酮類化合物是以2-苯基-1,4-苯并吡喃酮為母核而衍生的一類化合物。其中包括黃酮的同分異構體及其氫化的還原產物,亦即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物,即2個苯環通過3個碳原子結合而成。此類化合物廣泛存在于高等植物中,多呈黃色,是形成花色的重要成分,除了在花中存在外,在植物的各個器官和組織中都有分布。自1814年發現第一個黃酮類化合物——白楊素,至今已分離出的黃酮類化合物達數千種。它們常以游離態或與糖結合成苷的形式存在,對植物的生長、發育和抵御異物的侵入都起著重要作用。
荷葉中總黃酮的含量為6.21%[6],國內外學者從荷葉中分離鑒定的黃酮類化合物除了上文提到的之外還有:槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素、柯伊利素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、槲皮素-3-丙酯、楊梅黃酮香豆醇葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷[7]。趙小亮(2013年)等人從荷葉中分離得到異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷ガ、異鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖 -(1→6)-ギ、異鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖 -(1→6)-[α -D-來蘇糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷]バ。異鼠李素-3-O-α -D-來蘇糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷ビ、槲皮素-3-O-蕓香糖苷ブ、槲皮素ボ、3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷ゼ、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷デ)),其中I~Ⅳ為首次從荷葉中分離到[8]。古山春夫首次從荷葉里發現了槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷[9]。張贇彬等用高速逆流色譜對荷葉提取物進行分離純化,結合薄層層析和顏色反應,從荷葉中分離得到2種黃酮醇類化合物:槲皮素-3-丙酯和山奈酚[10]。現代藥理研究表明,黃酮類化合物在心血管系統、內分泌系統和抗腫瘤方面具有明顯作用,如荷葉黃酮具有抗氧化、降脂減肥、抑菌等作用。
生物堿是存在于生物體內,含負氧化態氮原子,具有環狀或非環狀結構的次生代謝產物。生物堿主要分布于植物界高等植物中,尤其是在雙子葉植物小蘗科、毛莨科、木蘭科、防已科、罌粟科等中廣泛存在;少數存在于石蒜科、百部科、百合科等單子葉植物中。在1804年由德國化學家Serturner從鴉片中分離出咖啡以來,迄今已分出1萬余種,結構多樣,性質各異。它們少數以游離態存在,大多數與鹽酸、檸檬酸、草酸、硝鹽等形成鹽的形式,也有與糖形成苷的,如貝母堿苷、喜樹堿苷,也有一些生物堿與有機酸結合成酯的形式存在,如藜蘆生物堿酯、烏大生物堿C-8位羥基與乙酸戍酯等。
荷葉中生物堿的含量為1.435%[11],至今已從荷葉中分離出16種生物堿,根據母核不同將其分為3類,分別是阿樸啡類、去氫阿樸啡類、單芐基異喹啉類。荷葉中的生物堿具有降脂減肥、抗病毒、抑菌、抗驚厥等生理作用。
植物揮發油是天然植物和香料的精華,是一類相對分子質量較小的植物次生代謝產物,蘊含于植物香料體內。揮發油在植物體中的存在部位常各不相同,有的植物整株中都含有,有的則集中在花、果、葉、根或根莖等器官中,隨植物品種不同而差異較大。迄今為止發現含有揮發油的植物有3 000余種,其中具有商業價值的約數百種,適用于食品的約百余種。含精油較為豐富的植物科屬有:禾本科、松柏科、龍樟香科、木蘭科、菊科、樟科、姜科、蕓香科、唇形科、傘形科等。同一植物的藥用部位不同,其所含的揮發油組成成分也有差異,如樟科桂屬植物的樹皮揮發油多含桂皮醛,葉中則主要含丁香酚,而根和木則含樟腦多。
荷葉中精油含量為2.115%[12]。用普通粉與超微粉對荷葉中揮發油的化學成分進行分析,2種粉末鑒定出84種化學成分。超微粉比普通粉多鑒定出18種化學成分,在普通粉中鑒定出的物質中有17種未在超微粉中檢出。荷葉揮發油中主要化學成分為(普通粉,超微粉):鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)-鄰苯二甲酸酯(31.63% ,29.21%)、6-辛基乙基-3-(2-乙基己基)-鄰苯二甲酸酯(0,13.45%)、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(3.16%,4.77%)、β-紫羅蘭酮(1.26%,1.73%)、11,13-二甲基-12-十四碳烯-1-醇乙酸酯(1.50% ,2.92%)等[13]。
彭雙等人采用正相硅膠、反相 ODS、Sephadex LH-20等柱色譜及PHPLC進行分離純化,并通過理化性質、光譜分析法及與文獻對比,首次從蓮屬植物中分離得到 4 個降倍半萜類:(3S,5R,6S,7E)-5,6-epoxy-3-hydroxy-7-me-gastigmen-one、4,5-dihydroblumenol A、(E)-3-oxo-retro-α-ioniol、(3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetraol。[14]
多糖又稱多聚糖,是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖,其分子質量一般為數萬甚至數百萬。至20世紀50年代,自從Brander報道了酵母細胞壁多糖(zymosan)具有抗腫瘤活性以后。近年來,隨著免疫物質、生物膜以及多種生物活性物質的研究進展表明,糖類在生物體內功能不限于提供能量和參與結構,糖類在分子識別、物質運輸和信息傳遞中都起著關鍵作用,與抗原-抗體、受精、胚胎形成、細胞發育等重要生理過程息息相關。目前多糖的研究已成為人們關注的一個熱點。
荷葉中多糖的含量是4.25%[15],顏色為灰白色,主要多糖級分為酸性多糖為主,是阿拉伯糖為主要單糖的多糖,同時還夾雜著少量的甘露糖、葡萄糖和半乳糖。根據標準可推算阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖摩爾比為14∶3∶3∶3[16]。
木脂素,又稱木脂體,是一類由苯丙素氧化聚合而成的天然產物,主要存在于植物的木質部或開始析出時呈樹脂狀,所以稱木脂素。組成木脂素的苯丙素單元分子已發現有多種類型,但常見的主要有桂皮酸、桂皮醇、苯丙烯和烯丙苯四種。少數木脂素可能兩種類型單體混合組成。木脂素類化合物主要分為木脂素和新木脂素兩大類。前者是指兩分子苯丙烷通過側鏈中β-碳原子(8-8’)連接而成的化合物;后者指兩份苯丙烷以其他方式(8-3’,3-3’)相連而成的化合物。除上述兩大類型外,還有雜木脂素、倍半木脂素、二木質素、苯丙素低聚體等其他類型的木脂素。
彭雙等人從荷葉的70%的乙醇提取物中分離鑒定出了4個木脂素類:(+)-松脂醇[(+)-pinoresind,1]、(+)-表松脂醇[(+)-epipinoresinol]、Sylvatesmin、(+)-異落葉松樹脂醇[(+)-isolariciresinol][14]。此4種化合物將為首次從蓮屬植物中分離得到。
生物的生理活性由有機成分與無機成分協同作用產生的,并證實了有機結合態微量元素較無機態具有更強的活性;不同生物中同一微量元素的活性不同與其含量和存在形態有關。對176種中藥的功效與4 種微量元素(Fe、Mn、Zn、Cu)的含量分析發現,具有收澀、溫里、芳香化濕、補陽作用的中藥,其含Mn量較高,具有平肝熄風、清熱活血、補陰作用的藥中Zn含量較高[17]。
黃明堦[17]等測定了荷葉無機營養元素含量,結果表明不同時期荷葉中7種元素含量差異極顯著,但嫩、老荷葉都含有豐富的Mn、Fe、Zn、Cu等微量元素,各元素含量順序為K>Ca>Mg>Mn>Fe>Zn>Cu,(嫩、老)荷葉中 K,Ca,Mg,Mn,Fe,Zn,Cu 的含量為(μg/g):22 285.78、15 530.16,6 213.45、11 309.41,1 898.33、1 750.42,353.32、738.04,65.78、74.30,39.80、30.35,12.72、10.48;荷葉對 Mn 元素有較強的富集作用,10月份采集的茶葉錳含量高達1 278.76 mg/g,比一般中藥高出近30倍。錳對血脂、血糖、血壓都有影響,具有抗氧化、抗衰老及抗化學致癌作用。
(2)噴播植被法是在礦業廢棄地(主要是邊坡)上噴射物理阻隔材料、化學穩定劑使之反應形成堅實外殼,或施加化學物質來絡合重金屬離子和堿性中和基質,選用粘土、河沙、秸稈粉碎料、珍珠巖等物理阻隔材料與植物種子混合均勻,選用專有設備進行噴灑,在重力作用自然入滲,從而形成穩定的隔水層,達到植物定居的目的。但這種屬于硬性隔離,植物根系無法深入,因為植物材料噴播,無法調控種間植物生長關系,生物多樣性無法保證,植被系統穩定性差,容易發生退化現象。
嬾荷葉鉀含量為2 285.78 mg/g,比一般中藥高出近10倍。鉀離子可降低腎素釋放,擴張血管,提高鈉-鉀-ATP酶的活力以改善水鈉的潴留,這和荷葉清熱、利濕、利水的功效可能有直接關系。趙飛[18]測得云南石屏縣荷葉中鋰平均含量為18.50 mg/g,比茶葉、苦丁茶、野生肉蓯蓉、榆錢等相比,荷葉中鋰含量高得多。預示荷葉可有利降低糖尿病人血液中的血糖,也可有助于治療神經紊亂癥。
荷葉中含有有機酸類成分如酒石酸、沒食子酸、酒石酸等;其它類化合物如:1-十一烷醇、1-二十烷醇、(2R,4S,4aS,8aS)-4,4a-環氧-4,4a-二氫食用西番蓮素等。
黃酮的提取方法有溶劑法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法,近年來荷葉黃酮的提取方法如表1所示。

表1 荷葉黃酮不同提取方法比較Table 1 Comparison of flavonoids in Folium Nelum binis by different extraction methods
黃酮類化合物的分離主要包括2方面:一是黃酮類化合物與非黃酮類化合物的分離,二是黃酮類化合物中的單體分離。黃酮類化合物的分離、純化原理主要有3個方面:(1)依據化合物極性大小不同,利用各種吸附色譜或分配色譜進行分離;(2)根據分子大小不同(相對分子質量的大小),利用葡萄糖凝膠分子篩進行分離;(3)根據化合物酸性強弱不同,利用梯度PH萃取法進行分離[25]。
現將荷葉黃酮類化合物的分離純化方法比較如下。見表2。

表2 荷葉黃酮分離純化方法比較Table 2 Comparison of flavonoids in Folium Nelum binis by different separation and purification methods
植物中生物堿含量較低,大多小于1%,如長春花的長春新堿含量只有百萬分之一。而植物所含成分十分復雜,既有有效成分,又有無效成分和有毒成分。為了提高植物的治療效果,就要盡量大限度地提取有效成分,去除無效成分及有毒成分。因此,如何從天然產物中提取與分離生物堿,吸引人們的廣泛關注。
現將荷葉生物堿的提取方法比較如下,見表3。

表3 荷葉中生物堿的提取方法比較Table 3 Comparison of alkaloids in Folium Nelum binis by different extraction methods
生物堿的分離方法很多,除經典的分離方法,如溶劑萃取法、蒸餾法、沉淀法、鹽析法、結晶法外,還有許多現代、先進的分離方法,如色譜分離法。
2.4.1 色譜分離法
劉婧靖等人利用荷葉提取物經1%鹽酸水溶液提取后,用三氯甲烷萃取,然后用Prep-HPLC分離制備。采用流動相中乙睛與0.2%三乙胺水溶液體積比為 30∶70,進樣量為 1 mL[32]時,上樣量為 8 mg 左右時不影響分離度,且質量分數符合質量要求(98%,HPLC)。pH區帶逆流色譜(PH-ZRCCC)利用待分離有機酸堿的酸(堿)解離常數及疏水性的不同進行分離。與普通逆流色譜相比,其突出特點是在溶劑體系的固定相中加入保留酸(或堿),同時在流動相中加入洗脫酸(或堿),不同物質洗脫出來時伴隨著PH值的突變,具有樣品分離容量大、分離純度高和分離效率高等優點[33-35]。采用溶劑系統為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比 3∶7∶1∶9),上相添加三乙胺(10 mmol/L)作為固定相,下相添加鹽酸(5 mmol/L)為流動相進行洗脫,在主機轉速850 r/min、體積流量2 mL/min,檢測波長272 nm條件下進行分離制備。結果從2.10 g荷梗生物堿粗糙提取物中一次分離得到53 mg O-去甲荷葉堿,純度大于98%[36]。
高速逆流色譜分離法(HSCCC)是種新的分離技術,它對生物堿的分離和制備具有很大的優勢如:(1)不需要固相載體,因而清除了氣相色譜中由于使用載體而帶來的吸附現象;(2)特別適用于制備性的分離,每次進樣體積較大,進樣量也較多[37]。
王穎瀅以正己烷-乙酸已酯-甲醇-水(體積比5∶5∶6∶4)為溶劑體系,采用HSCCC法在最優工藝條件:儀器轉速850 r/min,流動相流速2 mL/min,分離25℃下從荷葉生物堿中分離得到巴婆堿(純度91.25%)、O-去甲基荷葉堿(純度 96%)、N-去甲基荷葉堿(純度為 97.13%)和荷葉堿(純度為99.3%)[38]。
飛行時間質譜具有高分辨率,能夠不降低靈敏度而測定化合物精確的相對分子質量,在天然產物分析方面越來越受到重視。樣品采用1%HCl超聲提取,經固相萃取小柱凈化,再用氨水-甲醇進行洗脫,洗脫液濃縮后用甲醇定容。選用Welch Materials C18柱,以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫,在正離子模式下,經快速分離液相-飛行時間質譜(RRLC-Q-TOF)分析測定了9種生物堿分別是:去氫荷葉堿、蓮心堿、dl-去甲基衡州烏藥堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿、N-去甲基荷葉堿、蓮堿、荷葉堿、前荷葉堿[39]。
2.4.2 樹脂吸附分離法
樹脂吸附是一種分離有效成分的有效途徑。大孔樹脂是20世紀60年代末發展起來的一類有機高聚物吸附劑,具有吸附性強,吸附容量大,解吸條件溫和,洗脫率高,再生簡單,穩定性好,被廣泛地應用于制藥及天然植物中活性成分的分離純化[40]。
王玉霞等以體積分數90%乙醇提取荷葉得提取液,減壓回收溶劑,殘留物以1∶20的料液比質量分數為1%HCl超聲分散后,離心,上清液流經D00L-CC大孔陽離子交換樹脂柱,以50%乙醇5倍柱體積(BV)洗脫除雜,再用質量分數1%的氨性乙醇(濃度為70%)洗脫7BV,洗脫速度10 BV/h,得總生物堿含量在50%以上的荷葉生物堿部位[41]。崔炳群研究了大孔吸附樹脂純化荷葉生物堿,結果是吸附流速2 BV/h,上樣液pH值10,最大上樣量6BV,解吸流速2BV/h,洗脫液pH 3的70%乙醇溶液[42]。喬蓉研究了聚酰胺樹脂純化荷葉堿的工藝。結果表明在pH值為4,吸附時間為80 min時,聚酰胺樹脂對荷葉堿的吸附性能最好,飽和吸附量為1.54 mg/mL,用流速為1.0 BV/h的90%乙醇溶液洗脫樹脂上吸附的荷葉堿,洗脫率達到 66.8%[43]。
2.4.3 膜分離技術
膜提取分離是一種高新技術,它對生物堿的提取分離及其他有效成分的提取分離具有不發生相變,不消耗熱能,分離裝置簡單,不必添加化學試劑,不損害熱敏感物質,可極大地減少提取工序的優點。但處理能力小,需要消耗電能。
荷葉飲料中香氣的主要成分為醛類、酮類、醇類,他們占總香氣成分的比例為 19.69%、16.24%、6.25%,而且經過蓮子β-葡萄糖苷酶處理后的荷葉飲料香氣相對含量由3.21%上升至7.64%[44]。除此之外還含有黃酮、生物堿、高分子多糖體、三萜類物質等生理活性成分,以荷葉為主要原料的飲料對人體有多種保健作用,如:減肥作用、抗衰老作用、降低血糖、降低膽固醇、免疫調節作用等。
張蕾采用微波輔助干燥荷葉茶。工藝流程是:將新鮮嫩荷葉清洗除梗后,切為長3 cm,寬1.5 cm的條狀,采用水蒸氣殺青滅酶,然后揉念成型,經微波干燥處理后繼續熱風烘干即成品。結果表明微波法制得的荷葉茶一次性溶出率可達35%,比常規處理一次溶出率可提高20%以上,并且荷葉多糖、荷葉黃酮、荷葉生物堿均有很大提高[45]。龔吉軍等研制了荷葉茶。生產工藝流程是:將干荷葉粉碎后,經熱水浸提,過濾得荷葉湯,再與脫脂奶粉(70℃溶解均質)、蜂蜜(化糖過濾)、穩定劑(熱水溶解)調配后,再經均質、加熱,灌裝殺菌即成為成品,
結果表明奶茶的最佳配方為脫脂奶粉4%,蜂蜜2%,荷葉湯40%;最佳的復合穩定劑為藻酸丙二醇酯(PGA)0.09%,低甲氧基果膠(LMP)0.12%,羧甲基纖維素納(CML-Na)0.15%[46]。朱珍等研制了荷葉復合袋泡茶,當荷葉∶絞股藍∶西洋參的質量比為1.8∶0.2∶0.2時所得的荷葉袋泡茶品味醇香,清新自然。荷葉的苦澀味被西洋參的甘甜味所掩蓋,有效成分黃酮含量較純荷葉高[47]。趙林林等研制了1種老年型荷葉調配茶。結果表明,荷葉茶:枸杞∶山楂的最佳質量配比以80~90∶10~15∶7~13有利于茶香氣品質的形成,以80∶20∶7有利于提高茶綜合感官品質,以80∶15∶10有利于茶滋味品質的形成,以80~90∶10 ~20∶13 有利于茶湯色品質的形成[48]。
聞伯芹制備了荷葉功能茶:以茶湯中黃酮含量為指標,將荷葉、絞股藍、西洋參、決明子復配成2種茶葉復合茶。荷葉1.8 g,絞股藍0.3 g,決明子0.2 g,茶湯中黃酮含量為2.71 mg/g;荷葉1.8 g,絞股藍0.2 g,西洋參0.2 g,茶湯中黃酮含量2.59 mg/g。這2種茶均有一定的清除DPPH自由基、抑制油脂氧化、清除羥自由基的能力[49]。范濤研究了荷葉功能性飲料的制備。其工藝流程:原料→粉碎→熱燙→破碎打漿→酶解→滅酶→壓榨→離心→脫苦→調配→殺菌→裝瓶備用。山楂、蘋果→破碎打漿→壓榨→離心。
結果表明以5.0 g/L檸檬酸和10.0 g/L抗壞血酸為優選熱燙液,以纖維素酶和果膠酶混合酶解,酶解溫度50℃,pH 4.0時,其可溶性固形物為55.72 g/L,生物堿3.1 g/L,類黃酮2.0 g/L,還原糖1.58 g/L。脫苦劑β-CD用量為3.0 g/L時,提取液無明顯苦澀味。以此法可制得酸甜適宜,清涼可口的荷葉功能性飲料。
“第七營養素”膳食纖維同時也作為一種益生元,具有低熱量,低血糖生成指數的特點以及調節血脂、降低膽固醇、潤腸通便的功效。郝麗珍等以荷葉、膳食纖維等研制出了一種荷葉功能飲料。工藝流程:荷葉粉經紫外線殺菌后浸提,得粗提液后離心分離,然后加入白砂糖、膳食纖維、檸檬酸等調配澄清,再次離心分離后即可灌裝成品。最佳工藝配方為:荷葉提取液添加量30%,白砂糖6%,檸檬酸0.05%,膳食纖維0.5%,精制卡拉膠0.05%,以此制得口感細膩、清爽、圓潤的荷葉功能飲料[51]。
邵虎等以鮮牛乳為原料,適量添加荷葉和淡竹葉浸提液及其他輔料,研制出荷葉淡竹葉功能性含乳飲料。工藝流程:荷葉經熱水浸提后得到的荷葉浸體液,與熱水浸提的淡竹葉浸提液混合,然后經護色處理,再與白砂糖液、穩定劑液、檸檬酸液、鮮牛乳等調配,再預熱,經均質、殺菌以后即可灌裝成品。飲料的最佳配方是:鮮牛乳35%、荷葉浸提汁30%、淡竹葉浸提汁15%、白砂糖10%、檸檬酸0.15%、復合穩定劑0.15%[52]。周桃英以鮮乳、鮮荷葉汁、乳粉為主要原料研制出一種具抗腫瘤、抗癌等功能的酸奶。工藝流程:原料乳經凈化、標準化后,與鮮荷葉汁、荷葉粗黃酮、穩定劑、蔗糖、乳粉等配料調配后,再預熱均質,殺菌冷卻后即可接種,然后灌裝發酵,最后經后熟后即成為成品。荷葉酸奶的生產配方為:荷葉汁添加量12%,乳粉添加量3%,白砂糖添加量5%,0.05%的荷葉粗黃酮[53]。
進入21世紀以來,“飲食與健康”成為一個世界性話題。可用于開發功能性食品的生物活性物質越來越多,特別是植物來源的生物活性物質。目前國際上發現的一些熱點藥物大部分都是從民間、民族藥中發現的。蓮是世界上最古老的植物之一,荷葉是生產荷藕的副產品。如不加以利用,則污染河道、阻礙水流,使水質富營養化,河塘沼澤化。目前對荷葉提取工藝、藥理作用研究較多,但對其含量測定還沒有一個很好的標準,不利于荷葉質量的控制。“譜效學”的提出,為食品中藥的研究帶來了新的發展方向,這也是荷葉的未來發展趨勢。未來的荷葉研究方向應該是探明荷葉藥理活性與成分結構之間的關系,如降脂減肥的機理;對荷葉飲料的研究還停留在原始的浸提殺菌直接灌裝的老路上,未來荷葉飲料的發展趨勢應該是飲料的主劑化生產。
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