水蒸氣蒸餾法提取花椒精油及揮發(fā)性成分分析*

張懷予，王軍節(jié)，，陳園凡，魏晉梅，李貞子，方碩

1(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川，750021)2(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730124)

3(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅蘭州，730070)

花椒是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum L.)植物花椒的果皮，是常用的香辛料和重要的中藥，具有藥食兩用的價(jià)值［1］。花椒中含有大量的精油，是花椒香氣的主要來源。花椒精油不僅作為香料和調(diào)味品的基料，還因其具有殺蟲、驅(qū)蟲、抑菌及治病等特性而用于農(nóng)藥、醫(yī)藥等行業(yè)，具有廣闊的綜合開發(fā)前景［2-4］。目前精油的提取、成分分析及應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)［5-6］。精油提取的方法主要有水蒸氣蒸餾［7-8］、微波提取［9-10］、超聲波提取［11］、超臨界 CO2萃取［12］和亞臨界萃取［13］等，且不同方法［14］和不同資源［15］影響精油提取效率、化學(xué)組成及含量，同時(shí)工藝參數(shù)優(yōu)化可顯著提高精油得率［16］。然而甘肅花椒提取精油的工藝、優(yōu)化和化學(xué)組成則鮮有報(bào)道。本研究采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)甘肅武都大紅袍花椒的精油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)精油進(jìn)行分析和鑒定［17］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒為武都“大紅袍”品種，購自于甘肅蘭州永樂藥業(yè)有限公司。

9FZ-15B型多用粉碎機(jī)，四川簡陽市富強(qiáng)機(jī)械制造有限公司;水蒸氣蒸餾裝置;油水分離器;MH-500型可調(diào)式電熱套，HW型遠(yuǎn)紅外干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;10 μL微量進(jìn)樣針，上海安亭微量進(jìn)樣器廠;YP202N型0.01 g感量電子天平、FA2204B感量0.000 1 g電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;70目金屬篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司;Agilent 6890 GC-5973 MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;OV1701 60 m×0.25 mm(i.d)×0.5 μm色譜柱，中科院蘭州化物所;干燥器;15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾花椒精油工藝流程

花椒→粉碎→過篩→稱量→裝料→蒸餾→精油

粉碎、過篩:將粉碎的花椒粉末經(jīng)70目過篩，得到篩上物和篩下物。花椒的果實(shí)、籽、柄的部分所含精油的量不同，因此取用花椒粉末的質(zhì)量以篩上物和篩下物1∶2的質(zhì)量比值進(jìn)行分配，以達(dá)到較均勻取樣，從而減少所帶來的誤差。

裝料:將稱好的20 g花椒粉末裝入2 L圓底燒瓶中，并加入數(shù)顆玻璃珠，調(diào)整料液比，浸泡12 h，之后放入可調(diào)式電熱套進(jìn)行加熱，開啟冷凝管。

蒸餾:水蒸氣隨著沸騰進(jìn)入冷凝管冷卻，隨后進(jìn)入油水分離器，進(jìn)行油水分離，精油浮上面，水在下面，當(dāng)水開始下滴時(shí)，記錄時(shí)間，直到結(jié)束蒸餾，測量收集的水容積，即為蒸汽量。

精油:利用微量進(jìn)樣器吸出精油低部的水珠，將上述精油，通過裝有Na2SO4的干燥器，將得到的純精油，稱重后轉(zhuǎn)入精油瓶，并保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水蒸氣蒸餾花椒精油的單因素實(shí)驗(yàn)

選取料液比、蒸餾時(shí)間、蒸氣量3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以精油得率為指標(biāo)，確定各因素的優(yōu)化區(qū)間。

料液比:在蒸餾時(shí)間、蒸氣量不變條件下，料液比值(g∶mL)為 0.04、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 時(shí)，對(duì)精油得率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

蒸餾時(shí)間:在料液比、蒸氣量不變時(shí)，考察蒸餾時(shí)間分別為 30、60、90、120、150 min，對(duì)精油得率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

蒸氣量:在料液比、蒸餾時(shí)間不變條件下，選取蒸氣量為20、45、70、95、120 mL 時(shí)，對(duì)精油得率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 精油得率計(jì)算

1.2.4 水蒸氣蒸餾花椒精油響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇料液比值、蒸氣量、蒸餾時(shí)間3個(gè)因素為自變量，精油得率為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(CCD)優(yōu)化精油提取工藝，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 花椒精油揮發(fā)性成分分析

氣相色譜條件:OV1701色譜柱(中等極性，30 m×0.25 mm ×0.25 μm);采用程序升溫，50℃保持 2 min，以5℃/min速率升至250℃，保持10 min，載氣為高純度He(99.99%)，柱前壓50 KPa;載氣流量1.0 mL/min;氣化室溫度為250℃，進(jìn)樣量1 μL;分流比 1∶10。

質(zhì)譜條件:EI離子源;溫度250℃;四極桿溫度100℃;電子能量70 eV;接口溫度280℃;電子倍增器電壓1.8 kV;質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

采用NIST譜庫檢索，采用峰面積歸一法確定化學(xué)成分及相對(duì)含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比值對(duì)精油得率的影響

由圖1可知，料液比值對(duì)精油得率的影響為雙峰型變化，呈先增大后減小的趨勢。料液比值在0.04、0.05時(shí)精油得率均較低;隨著比值增大得率顯著增加，在0.1時(shí)達(dá)到最高峰，然后得率呈下降趨勢，0.2時(shí)得率輕微上升，最后得率隨比值進(jìn)一步增大而下降。因此，優(yōu)化的料液比值確定為0.05、0.1、0.15。

圖1 料液比值對(duì)精油得率的影響Fig.1 Effect of the material-water ratio on extraction yield of essential oil

2.1.2 蒸汽量對(duì)精油得率的影響

在圖2中，精油得率隨著蒸汽量的增加，而表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢。蒸汽量在70 mL時(shí)，達(dá)到最大值，之后隨著蒸汽量的增大，精油得率逐漸下降。故蒸汽量的優(yōu)化取值確定為45 mL、70 mL、和95 mL。

圖2 蒸汽量對(duì)精油得率的影響Fig.2 Effect of the vapour volume on extraction yield of essential oil

2.1.3 蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響

從圖3中看出，蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響呈單峰型變化。隨著蒸餾時(shí)間的增加，得率逐漸上升，當(dāng)時(shí)間90 min時(shí)，精油得率達(dá)到最高峰，而后隨著時(shí)間的延長，得率則不斷下降，到120～150 min時(shí)，得率變化極其微小。因此，蒸餾時(shí)間的優(yōu)化取值為60、90和120 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

圖3 蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響Fig.3 Effect of the distillation time on extraction yield of essential oil

以料液比值(A)、蒸氣量(B)、蒸餾時(shí)間(C)為自變量，以精油得率(Y)為響應(yīng)值，中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

采用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合和方差分析，得到精油得率對(duì)料液比值、蒸汽量及蒸餾時(shí)間的回歸方程為:

Y=6.56+0.46A+0.22B+0.23C+0.31AB-0.27AC-0.17BC-1.10A2-1.19B2-0.42C2

由方差分析表3可知，二次多項(xiàng)式模型 P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.310 2＞0.05，表明回歸方程擬合程度好，誤差小，該方程與實(shí)測值能較好的擬合;復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.973 9，說明回歸方程對(duì)精油得率的預(yù)測值與實(shí)測值有較好的相關(guān)性;校正決定系數(shù)Adj R2=0.950 4，表明95.04%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋;故可用該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。同時(shí)可知，除了蒸汽量(B)和蒸餾時(shí)間(C)交互作用BC對(duì)精油得率影響不顯著(P＞0.05)外，料液比值(A)、A2、B2、C2對(duì)精油得率影響均極顯著(P ＜0.01)，B、C、AB、AC 對(duì)得率影響均顯著(P＜0.05)，各因素對(duì)精油得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，而且影響精油得率的因素依次為料液比值＞蒸餾時(shí)間＞蒸汽量。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 CCD matrix and corresponding results

2.2.2 響應(yīng)面曲線圖分析

根據(jù)回歸方程，得到各因素交互作用對(duì)精油得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖(圖4)，其中等高線圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓表示兩交互作用顯著［20］。由圖4-a可知，蒸餾時(shí)間一定時(shí)，隨著料液比值與蒸氣量增加，精油得率呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)料液比值在0.09～0.11，蒸汽量在65～75 mL時(shí)，精油得率可達(dá)到最大值6.8%。其中，料液比值對(duì)精油得率的影響大于蒸汽量。圖中等高線圖為橢圓形，表明料液比值和蒸汽量兩因素的交互作用顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the developed regression model

圖4 各兩因素交互作用對(duì)精油得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of three factors on extraction yield of essential oil

由圖4-b可知，在蒸汽量不變時(shí)，料液比值對(duì)精油得率的影響為先增大后減小，蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響則為先上升后趨于平穩(wěn)趨勢。料液比值對(duì)精油得率的影響大于蒸餾時(shí)間。當(dāng)料液比值在0.09～0.11，蒸餾時(shí)間在85～95 min時(shí)，得率有最大值。等高線圖為橢圓形，說明料液比值和蒸餾時(shí)間兩因素交互作用顯著。

從圖4-c可以看出，蒸汽量對(duì)精油得率的影響呈快速升高后逐漸下降的趨勢，蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響則呈先上升后趨于平穩(wěn)趨勢。圖4-c中蒸汽量對(duì)精油得率的影響大于蒸餾時(shí)間，且結(jié)合表3可知，等高線圖接近圓形，在一定范圍內(nèi)兩因素交互作用不顯著。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)，得到水蒸汽蒸餾花椒精油工藝中料液比值、蒸汽量、蒸餾時(shí)間的最佳組合，最佳組合為:料液比值0.11、蒸汽量72.61 mL、蒸餾時(shí)間95.61 min，此條件下精油得率的預(yù)測值為6.64%。為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，將水蒸汽蒸餾花椒精油的最佳工藝條件修正為:料液比值0.11、蒸汽量73 mL、蒸餾時(shí)間96 min，并進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出精油得率為6.71%，與理論預(yù)測值較為接近，說明模型的擬合程度較好，回歸方程對(duì)水蒸汽蒸餾花椒精油工藝進(jìn)行分析和預(yù)測可靠，可以利用該工藝條件制備花椒精油。

2.3 花椒精油揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得的花椒精油進(jìn)行分析，GC-MS所得總離子流圖見圖5，通過對(duì)總離子流圖的各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過計(jì)算機(jī)質(zhì)譜譜庫檢索(選擇匹配度大于80%的結(jié)果)，結(jié)合保留時(shí)間，最終確定出花椒精油中的化學(xué)成分，并用面積歸一法計(jì)算各化學(xué)成分相對(duì)含量。

圖5 花椒精油揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of essential oil

由表4所示，花椒精油中共檢測出73種化學(xué)成分，經(jīng)鑒定的31種，占揮發(fā)油總量的95.16%，其中包括萜烯16種(39.93%)，醇 7種(29.65%)，酯 5種(22.84%)，醚1種(0.27%)，酮 1 種(2.32%)，烴 1種(0.15%)，并以萜烯、醇和酯類物質(zhì)為主。這31種成分中，檸檬烯(20.204%，檸檬香、柑橘香、甜香)和芳樟醇(16.645%，玫瑰的花香、木香、果香)［17］，鄰氨基苯甲酸芳樟酯(19.733%，甜橙的香氣)的含量較高，占揮發(fā)油總量的56.58%，是構(gòu)成甘肅大紅袍花椒精油的主要成分，特別是鄰氨基苯甲酸芳樟酯在以往花椒揮發(fā)油文獻(xiàn)中，含量在2% ～6%［19-20］，而本實(shí)驗(yàn)中的差異可能是花椒產(chǎn)地不同所致。

表4 花椒精油主要揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis results of main volatiles in essential oil

續(xù)表4

3 結(jié)論

以甘肅武都大紅袍花椒為原料，根據(jù)單因素及響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得到水蒸汽蒸餾法提取花椒精油的最佳工藝:料液比值0.11(g∶mL)、蒸汽量73 mL、蒸餾時(shí)間96 min，在該條件下實(shí)際精油得率為6.71%，與理論預(yù)測精油得率6.64%較為接近，可用該工藝進(jìn)行花椒精油的生產(chǎn)。

經(jīng)GC-MS對(duì)所制備的花椒精油進(jìn)行分析，精油中共檢測出73種化學(xué)成分，鑒定出其中31種，占揮發(fā)油總量的95.16%，并以萜烯、醇和酯類物質(zhì)為主。檸檬烯、芳樟醇和鄰氨基苯甲酸芳樟酯為當(dāng)?shù)鼗ń肪椭饕煞郑糠謩e達(dá)到20.204%、16.645%和19.733%。無論提取方法、花椒品種和產(chǎn)地不同，前人研究結(jié)果均表明檸檬烯和芳樟醇為花椒精油的主要成分［3，8，11，14-16］。檸檬烯具有抗腫瘤、抑菌、止咳、祛痰、平喘、溶解膽結(jié)石等功效［21-22］，而芳樟醇具有抑菌、抗腫瘤和鎮(zhèn)痛等作用［21-26］，因此，所提取花椒精油的藥用價(jià)值極高，是一種集營養(yǎng)、美味與保健于一體的植物精油［27］。本研究首次發(fā)現(xiàn)提取花椒精油中含有高含量鄰氨基苯甲酸芳樟酯，該成分的天然存在報(bào)道少見［28-30］，因此推測其來源可能是甘肅產(chǎn)花椒特有或提取過程中生成。鄰氨基苯甲酸芳樟酯具有類似甜橙水果香味［29］，但其在所提花椒精油中呈香作用尚不明確。因此，有關(guān)鄰氨基苯甲酸芳樟酯在該花椒精油中的來源、呈香貢獻(xiàn)和生物活性均有待進(jìn)一步研究。

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