中式香腸風(fēng)干過(guò)程中蛋白氧化對(duì)蛋白聚集、水解性及溶解性的影響*

吳滿剛，吳雪燕，于海，葛慶豐，汪志君

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225127)

中式香腸是我國(guó)傳統(tǒng)風(fēng)干香腸的主要代表，因風(fēng)味獨(dú)特、保質(zhì)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)使其受到人們的廣泛喜愛(ài)，它由瘦肉，脂肪，鹽，香料，添加劑(硝酸鹽、亞硝酸鹽和抗氧化劑)以及發(fā)酵劑(選擇性加入)混合加工而成［1］。肉制品加工過(guò)程中，蛋白質(zhì)表現(xiàn)出一系列功能性質(zhì)，如凝膠性使得產(chǎn)品經(jīng)加熱形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中各個(gè)組分相互作用表現(xiàn)出不同感官品質(zhì);在中式香腸風(fēng)干過(guò)程中，內(nèi)在因素(金屬離子、脂肪組成)和外在因素(氧氣、溫度、光照)都會(huì)促使其蛋白氧化，造成蛋白溶解性、乳化性、降解性等功能性質(zhì)的改變［2］，進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此，在加工過(guò)程中蛋白質(zhì)成分和功能性質(zhì)的變化對(duì)肉制品的結(jié)構(gòu)、感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有重要影響［3］。

蛋白氧化修飾主要包括蛋白變性(功能結(jié)構(gòu)損失)以及在外源酶和/或內(nèi)源酶下水解降解(蛋白酶水解)。肉制品加工過(guò)程中蛋白質(zhì)降解作用對(duì)產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)、口感或風(fēng)味的形成有重要意義［4］:脂類分解是干熏肉制品加工過(guò)程中最重要的生化變化之一，脂類易被脂酶水解成游離脂肪酸。伴隨游離脂肪酸的釋放，脂肪酸的次級(jí)反應(yīng)會(huì)生成自由基［5］。在肉加工過(guò)程中(切碎、腌漬、烹飪、輻照等)，來(lái)自脂類分解的氧自由基的累積易造成蛋白氧化損傷［6］，而蛋白氧化誘導(dǎo)多種氨基酸發(fā)生修飾，形成羰基衍生物［7］。蛋白氧化導(dǎo)致硫醇基和酪氨酸含量下降，分別形成二硫鍵和二酪氨酸，在模擬實(shí)驗(yàn)中二硫鍵和二酪氨酸的形成與蛋白功能改變有關(guān)［8］。在生物醫(yī)學(xué)研究中，蛋白氧化和蛋白水解之間的相互作用已被廣泛研究。例如，增加表面疏水性有利于蛋白酶降解蛋白質(zhì)，然而蛋白質(zhì)在高度氧化情況下內(nèi)部分子發(fā)生交聯(lián)作用形成聚合物導(dǎo)致其對(duì)蛋白酶敏感性降低［9］。已有研究報(bào)道過(guò)肉制品中氨基酸氧化，蛋白質(zhì)聚集以及蛋白氧化和蛋白水解的相互關(guān)系［10-11］，但總體而言，關(guān)于肉制品加工過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化變化對(duì)中式香腸蛋白質(zhì)性質(zhì)影響的相關(guān)研究還比較少。

本文以中式香腸為研究對(duì)象，提取香腸中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，跟蹤監(jiān)測(cè)分析蛋白在香腸風(fēng)干過(guò)程中氧化指標(biāo)，并結(jié)合分析蛋白溶液渾濁度、蛋白SDS-PAGE電泳圖及蛋白溶解性，以期明確蛋白氧化在香腸風(fēng)干過(guò)程中與蛋白聚集、蛋白水解和蛋白結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬里脊肉、豬背肥膘、腸衣、配料等;5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、2，4-二硝基苯肼、碘化汞、茚三酮，均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中式香腸的制作

里脊肉與豬肥膘按照質(zhì)量4∶1比例混合，每100 g肉中加入白糖7 g，食鹽3 g，大曲2 mL，生姜0.15 g，味精 0.2 g，五香粉 0.1 g，水 10 g。

原料肉→漂洗→斬拌(肥、瘦肉切成8～10 mm大小的肉粒)→配料→灌腸(單根腸長(zhǎng)度18～20 cm，直徑4.2～4.5 cm，灌注原料肉110 g)→結(jié)扎→晾掛自然風(fēng)干(15℃，10 d)→成品

香腸灌制結(jié)束后風(fēng)干過(guò)程中分別在0、5、10、15、20、25、30 d 取樣，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 蛋白提取方法

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取方法參照文獻(xiàn)［12］。

1.2.3 蛋白氧化指標(biāo)的測(cè)定

羰基含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)［13］，游離硫醇基含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)［14］。

1.2.4 濁度測(cè)定

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液稀釋到2 mg/mL在室溫(25℃)放置20 min后，測(cè)其340 nm吸光度(A340)［15］。

1.2.5 蛋白質(zhì)表面疏水性

1.2.5.1 肌漿蛋白的表面疏水性

參照 Cardamone［16］的方法，并作改進(jìn)。采用 1-苯胺基-8-萘磺酸［1-(aniline)naphthalene-8-sulfonate，ANS］熒光探針?lè)y(cè)定肌漿蛋白的表面疏水性。采用10 mmol/L，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液將肌漿蛋白溶液稀釋至濃度分別為 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL的稀蛋白溶液。4mL蛋白溶液加上20 μL 8 mm ANS溶液，混合5 s，靜置3 min。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫校正均為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)的濃度做曲線，曲線初始階段的斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.2.5.2 肌原纖維蛋白的表面疏水性

參照 Martinaud［17］和 Chelh［18］方法，取 10g 香腸，剔除可見(jiàn)脂肪，加入100 mL pH 6.5的緩沖液(150 mmol/L NaCl，25 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，4 mmol/L EDTA和1 mmol/L PMSF)，冰浴中勻漿30s，混合液過(guò)60目篩以去除基質(zhì)蛋白。濾液10 000×g離心15 min。沉淀用100 mL pH 6.4的50 mmol/L KCl溶液洗滌2次，再用100 mL pH 6.0的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌1次。沉淀用pH 6.0的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，蛋白濃度調(diào)成5 mg/mL。

1 mL蛋白懸浮液中加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，均勻混合。對(duì)照為1 mL的20 mm(pH 6.0)磷酸緩沖液加入300 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液。樣品和對(duì)照在溫室下持續(xù)攪拌10 min，在離心機(jī)中2 000×g離心5 min。上清液稀釋10倍，以磷酸鹽做空白，在595 nm下測(cè)定吸光值。表面疏水性的計(jì)算公式:

1.2.6 SDS-PAGE方法檢測(cè)蛋白水解變化

參照郭君堯［19］的方法對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。蛋白與樣品緩沖溶液按體積比1∶1混合，100℃水浴加熱5 min。選取12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時(shí)初始電流為10 mA，當(dāng)樣品前沿剛好進(jìn)入分離膠后將電壓提高到20 mA，電泳時(shí)間約2 h。

染色:加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(V甲醇∶V冰醋酸∶V水=45∶10∶45，并加入0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250)，混合染色40 min。

脫色:用清水清洗凝膠，加脫色液(V甲醇∶V冰醋酸∶V水=5∶5∶40)，于脫色搖床上反復(fù)多次脫色。

1.2.7 蛋白溶解性研究

香腸蛋白溶解性的測(cè)定方法參照Roussel［20］的方法，略作修改。溶解液包括:(S1)0.06 mol/L KCl;(S2)20 mmol/L Tris，pH 8.0;(S3)20 mmol/L Tris，pH 8.0 包含10 g/L SDS;(S4)20 mmol/L Tris，pH 8.0包含10 g/L SDS和8 mol/L尿素;(S5)20 mmol/L Tris，pH 8.0包含10 g/L SDS，8 mol/L 尿素和體積分?jǐn)?shù)2%β-巰基乙醇;(S6)0.5 mol/L NaOH。取2g香腸，分別加入20 mL以上試劑中，室溫中磁力攪拌4h。S5在攪拌前100℃水浴中加熱2 min。所有樣品在12 100×g下離心30 min。取4mL上清液加入0.5 g/mL TCA(最終濃度為10%)。樣品在3℃下靜置18 h，2 500×g下離心20 min。沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液溶解，雙縮脲方法測(cè)定蛋白含量，牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)樣品。溶解性結(jié)果用各部分蛋白占S6的百分比表示。

2 分析與結(jié)果

2.1 成熟過(guò)程中蛋白羰基含量的的變化

風(fēng)干過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中羰基含量變化如圖1所示。

肌原纖維蛋白的羰基值明顯高于肌漿蛋白。肌漿蛋白羰基含量呈緩慢上升趨勢(shì)，風(fēng)干結(jié)束時(shí)達(dá)到5.03 nmol/mg蛋白。前15d肌原纖維蛋白羰基值含量呈上升趨勢(shì)，15d后開(kāi)始下降，分析其原因可能是蛋白質(zhì)羰基會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的反應(yīng)，例如蛋白質(zhì)羰基氧化成酸類物質(zhì)，羰基分子之間形成醇醛縮合物，蛋白質(zhì)羰基與氨基酸之間形成甲亞胺等［21］。

圖1 風(fēng)干過(guò)程中香腸肌漿蛋白和肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig.1 Changes in the carbonyl content of sarcoplacmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

蛋白羰基是蛋白氧化的主要產(chǎn)物，主要通過(guò)以下4個(gè)途徑形成:(1)賴氨酸，蘇氨酸，精氨酸和脯氨酸側(cè)鏈的直接氧化;(2)在還原糖的作用下發(fā)生非酶糖化反應(yīng);(3)通過(guò)α-酰胺化途徑或在谷酰基側(cè)鏈氧化情況下多肽鏈的氧化斷裂;(4)與非蛋白羰基如4-羥基-2-壬醛(HNE)或丙二醛(MDA)共價(jià)結(jié)合［21］。蛋白氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。賴氨酸的游離NH2與脂肪氧化的產(chǎn)物醛類物質(zhì)的相互作用形成席夫堿，從而誘導(dǎo)蛋白聚集［22］。此外，蛋白氧化也會(huì)改變蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使蛋白物理性質(zhì)發(fā)生改變，如蛋白表面疏水性升高和蛋白溶解性降低［11］。

2.2 成熟過(guò)程中巰基含量的變化

香腸蛋白氧化敏感性也可通過(guò)游離硫醇基含量變化體現(xiàn)出來(lái)，結(jié)果如圖2所示。在香腸風(fēng)干過(guò)程中，肌漿蛋白中巰基含量顯著高于肌原纖維蛋白中巰基含量。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白巰基含量整體呈下降趨勢(shì)，分別從113.2和57.5 μmol/mg蛋白下降到53.54和42.22 μmol/mg蛋白。硫醇基含量降低主要是由于蛋白表面的半胱氨酸中的游離硫醇基發(fā)生氧化，形成了二硫鍵。

圖2 風(fēng)干過(guò)程中香腸肌漿蛋白和肌原纖維蛋白巰基含量的變化Fig.2 Changes of S-H group levels of sarcoplacmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

在食物的加工過(guò)程中，加熱、機(jī)械剪切力和暴露在空氣或油-水界面等條件都會(huì)改變蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這些外在因素能引發(fā)巰基和胱氨酸與水接觸，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)形成二硫鍵。魚肉醬、香腸和酸奶等食物的形成中，二硫鍵對(duì)獲得良好的蛋白質(zhì)功能起重要作用［23］。這種現(xiàn)象可能對(duì)香腸中蛋白-蛋白之間的相互作用和聚集物的形成有重要影響。

2.3 香腸風(fēng)干過(guò)程中濁度變化

濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。溶液中蛋白質(zhì)聚集形成顆粒的數(shù)目越多、體積越大，濁度就越大［24］。如圖3所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的渾濁度在呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明了香腸成熟期間蛋白聚集物逐漸增多。

圖3 風(fēng)干過(guò)程中香腸肌漿和肌原纖維蛋白濁度的變化趨勢(shì)Fig.3 Changes ofturbidity sarcoplacmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液濃度在相同的情況下，肌原纖維蛋白的濁度比肌漿濁度大，說(shuō)明肌原纖維蛋白更易氧化聚集。蛋白渾濁度的上升表明香腸在風(fēng)干過(guò)程中蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，疏水基團(tuán)暴露，暴露的疏水基團(tuán)使蛋白聚集。

2.4 香腸風(fēng)干過(guò)程中蛋白水解情況

肌漿蛋白的分子質(zhì)量范圍是14～150 kDa，其特征條帶有磷酸化酶(150 kDa)，肌酸激酶(100 kDa)，磷酸甘油酸酯變位酶(45 kDa)，磷酸甘油酸酯激酶(35 kDa)，磷酸丙糖異構(gòu)酶(20 kDa)。在蛋白質(zhì)水解作用或者酸、鹽誘導(dǎo)的“變性”情況下，這些蛋白含量可能會(huì)減少。從第10天開(kāi)始，分子質(zhì)量為150 kDa左右的蛋白條帶發(fā)生大量降解形成更多小分子片段。

肌原纖維蛋白的特征條帶有肌球蛋白重鏈(MHC，200 kDa)，α-輔助肌動(dòng)蛋白(94 kDa)，原肌球蛋白(80 kDa)，肌鈣蛋白(75 kDa)，肌動(dòng)蛋白(45 kDa)和肌球輕鏈(20 kDa)。肌原纖維蛋白與肉制品緊密結(jié)合的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)固的質(zhì)地有關(guān)，所以其對(duì)肉制品加工起著至關(guān)重要的作用。MHC和肌動(dòng)蛋白條帶隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變淺，30 kDa和25 kDa處的蛋白發(fā)生降解，同時(shí)α-輔助肌動(dòng)蛋白條帶也發(fā)生降解。

圖4 肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretograms of sarcoplacmic proteins

圖5 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoretograms of myofibrillar proteins

香腸風(fēng)干期間，肌肉細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上的肽鏈內(nèi)切酶(鈣蛋白酶Ⅰ，Ⅱ和組織蛋白酶B，D，H，L)和微生物蛋白酶促進(jìn)了蛋白降解的發(fā)生［25］。在低水平氧化情況下，蛋白結(jié)構(gòu)的微小改變有利于蛋白酶水解位點(diǎn)的識(shí)別，蛋白水解性增強(qiáng)。在高氧化水平情況下，蛋白聚合物的形成以及特殊氨基酸側(cè)鏈的氧化都會(huì)改變識(shí)別位點(diǎn)，因此蛋白水解性降低［11］。不同時(shí)間段蛋白水解率的差異可能與氧化程度有關(guān)。以上變化表明中式香腸蛋白在成熟期間發(fā)生氧化降解。

2.5 風(fēng)干過(guò)程中蛋白表面疏水性變化

香腸風(fēng)干過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性變化情況如圖6所示。肌漿蛋白是一種水溶性蛋白，采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定其表面疏水性。風(fēng)干前20 d肌漿蛋白表面疏水性呈上升趨勢(shì)，第20天時(shí)達(dá)到最大值，25 d開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。肌原纖維蛋白是一種鹽溶性蛋白，采用疏水性基團(tuán)與溴酚藍(lán)結(jié)合的方法測(cè)定其表面疏水性。前25 d肌原纖維蛋白的疏水性呈升高趨勢(shì)，25 d后有所下降。

圖6 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

疏水作用力是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力。蛋白質(zhì)的疏水性能反映出蛋白質(zhì)化學(xué)和物理性質(zhì)的微小變化，是評(píng)價(jià)蛋白變性的一個(gè)重要參數(shù)。大量研究表明蛋白疏水性和蛋白氧化有關(guān)，氧化會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水氨基酸暴露出來(lái)，從而增加蛋白的表面疏水性［19］。以上結(jié)果表明香腸蛋白在風(fēng)干過(guò)程中發(fā)生氧化，蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來(lái)導(dǎo)致表面疏水性增加。另有研究表明蛋白質(zhì)在酶作用下降解，也會(huì)使蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來(lái)［23，26］。

2.6 香腸風(fēng)干過(guò)程中蛋白溶解性變化情況

香腸風(fēng)干過(guò)程中蛋白溶解性變化情況如圖7所示。隨著風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)在溶液S1和S2中的溶解度呈降低趨勢(shì)，分別從36.62%到18.97%和從43.67%降低到24.54%，分析其原因可能是香腸在風(fēng)干過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性或降解導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失。香腸風(fēng)干過(guò)程中蛋白在溶劑S3和S4呈增長(zhǎng)趨勢(shì)表明氫鍵和疏水作用力是穩(wěn)定香腸蛋白質(zhì)的重要作用力。相比之下，含有2%的β-巰基乙醇的溶劑(S5)具有更高的溶解度，這表明二硫鍵對(duì)增強(qiáng)香腸蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的作用。

蛋白質(zhì)與溶劑之間有相互作用力，包括氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用。本研究采用5種不同的溶劑規(guī)避不同的蛋白質(zhì)相互作用力，利用KCl規(guī)避靜電相互作用力，SDS規(guī)避氫鍵，尿素規(guī)避疏水相互作用力，巰基乙醇打斷二硫鍵，分別考察上述不同分子作用力對(duì)中式香腸蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)［3］。此研究結(jié)果表明氫鍵、疏水作用力和二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定具有重要意義。

3 結(jié)論

圖7 香腸風(fēng)干期蛋白溶解度變化Fig.7 Changes in solubility of Chinese-style sausage during drying of Chinese-style Sausage

中式香腸風(fēng)干過(guò)程中，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白羰基值呈上升趨勢(shì)，且游離硫醇基值的流失，說(shuō)明香腸蛋白在風(fēng)干過(guò)程中蛋白發(fā)生了氧化。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的濁度和表面疏水性上升趨勢(shì)表明蛋白氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)易暴露出來(lái)導(dǎo)致表面疏水性增加，蛋白溶解度下降導(dǎo)致蛋白聚集程度增加，但蛋白氧化對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(如α-螺旋，β-折疊含量)的影響有待進(jìn)一步研究。SDS-PAGE電泳圖顯示蛋白氧化導(dǎo)致蛋白發(fā)生不同程度的降解，但確定電泳圖中具體蛋白條帶的氧化還需要結(jié)合蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。中式香腸蛋白質(zhì)相互作用力在加工過(guò)程中顯著變化，隨著蛋白氧化的進(jìn)行，風(fēng)干后期穩(wěn)定中式香腸蛋白質(zhì)的作用力主要有氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵。

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