靈芝子實體多糖提取方法優化及不同來源赤芝子實體的多糖分子質量比較*

孫小梅，戴軍，陳尚衛，朱松

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

靈芝在我國作為傳統的藥食兩用真菌已有2 000多年歷史，是中華醫藥學寶庫中的珍品。國內外諸多研究表明，靈芝的藥理活性歸因于其含有的多糖、三萜類、腺苷類、生物堿、甾醇和氨基酸等，它們在靈芝的藥用保健功能中發揮著很重要的作用［1］。許多文獻報道靈芝多糖具有調節免疫［2-5］、抗腫瘤［6-7］、抗氧化［8-9］、抗肝炎［10］以及抗糖尿?。?1］等生物活性，被認為是靈芝中活性最大、效用最高的成分。

我國分布有大量的不同種類靈芝，而同一個靈芝品種在不同的環境中生長，其子實體的營養成分含量，組成及結構等也會有較大的差異［12-15］。而不同來源的靈芝的多糖分子質量分布、糖組成及結構不同，其生物活性也不相同。據報道，靈芝多糖分子質量大于1×104時，顯示強抑制腫瘤活性［10］。而不同提取方法提取得到的靈芝多糖，其分子質量分布和結構不盡相同，活性也有差異。活性強弱與其相對分子質量、溶解度、多糖鏈的分支程度及支鏈上羥基取代的數量、糖苷鍵的類型、以及多糖的立體構型等有關［16］。現今，市場上各類靈芝類保健品越來越多，人們對其保健功效質量優劣的要求也越來越高，對靈芝以及靈芝產品的質量檢測與控制也尤為重要。為了建立快速有效且可靠的分析檢測方法，以及避免在實際生產應用中靈芝多糖的生物活性受到影響，選擇合適的多糖提取方法也十分重要。本研究擬采用4種提取方法提取靈芝子實體多糖，通過比較多糖得率以及所得多糖的分子質量分布來選擇最優提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 樣品與試劑

乙醇(分析純);超純水;濃H2SO4(分析純);苯酚;NaNO3(分析純);葡萄糖對照品;Dextran系列葡聚糖標準品;11個赤芝子實體樣品，分別收集自山東、福建、浙江、遼寧等地區。

1.1.2 儀器與設備

Waters 600高效液相色譜儀，配置Waters 600四元泵，2410示差折光檢測器，7725i進樣閥，Empower 2色譜工作站;721N型可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;KQ-250DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;CEM-MARS5型微波消解系統，美國CEM公司;ASE100加速溶劑萃取儀，美國DIONEX中國有限公司;5415D小型高速離心機;QT-1漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;RE52-2旋轉蒸發儀，上海滬西分析儀器廠;SHZ-3循環水多用真空泵，上海滬西分析儀器廠;HH-S數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療儀器廠;Avanti J-E多用高效冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝多糖的提取

將收集的不同的靈芝子實體樣品置真空干燥箱中35℃烘干，切片粉碎。準確稱取靈芝子實體樣品約5.00 g，加純水浸泡過夜，再分別在超聲波、微波、加速加壓或者回流等輔助條件下提取，經濃縮、醇沉、離心、洗滌、離心、干燥等，得粗多糖水溶液。

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品繪制標準曲線。

多糖得率/%=［提取液中多糖含量(g)/靈芝粉樣品質量(g)］×100

1.2.3 高效體積排阻色譜法分析多糖分子量分布

(1)色譜條件。色譜柱:Waters UltrahydrogelTM Linear 2根串聯(7.8 mm×300 mm);檢測器:示差折光檢測器(RID);流動相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.6 mL/min;柱溫:45℃。

(2)分子質量標準曲線。將不同分子質量的葡聚糖標準品配置成約3 mg/mL的溶液，進樣分析。根據每個標樣的保留時間和對應分子質量的對數值，由GPC軟件自動作出分子量標準曲線。

(3)樣品分子質量分布分析。對上述1.2.1中提取得到的多糖溶液，分別進樣分析。根據上述得到的分子量標準曲線，由GPC軟件自動計算出每個樣品的色譜圖中各個峰的相對分子質量。

2 結果分析

2.1 不同提取方法多糖提取率比較

2.1.1 超聲波輔助提取

單因素實驗優化超聲波輔助提取時間、溫度以及料液比等對靈芝多糖提取的影響，結果見圖1。超聲功率額定為250 W，圖1-a顯示隨著提取溫度升高，多糖得率不斷增大。圖1-b表明超聲時間越長，多糖得率越高，60 min時得率最大，之后有下降趨勢，可能是由于長時間超聲作用使多糖降解，得率反而下降。圖1-c顯示料液比對多糖得率的影響相對不大，隨著提取溶劑比例增加，得率也變大，但變化幅度較小。

圖1 超聲輔助提取靈芝子實體多糖單因素實驗Fig.1 Single factor experiments of ultrasonic-assisted extraction method

在以上單因素實驗的基礎上進行正交試驗優化最佳提取條件，正交試驗結果見表1。

表1 超聲輔助提取正交試驗結果Table 1 Results of ultrasonic-assisted extraction orthogonal tests

比較超聲時間、溫度以及料液比3個因素的極差R:R(超聲溫度)＞R(超聲時間)＞R(料液比)，可見超聲溫度是關鍵的影響因素。超聲波輔助提取的最優條件為:料液比 1∶20，70 ℃，50 min，提取率為0.610%。在選擇的最佳條件下，進行3次重復的驗證實驗，所得的多糖得率分別為0.634%、0.621%、0.617%，說明選擇的超聲輔助提取條件基本穩定。

2.1.2 微波輔助提取

單因素實驗結果見圖2。微波溫度對多糖得率的影響明顯，溫度升高，多糖得率也增大;隨著微波時間增加，多糖不斷被提取出來，但得率增長幅度不大，可能是因為大分子質量的多糖不能被提取出來，也可能是因為微波能破壞多糖結構，使多糖得率較小。同樣，提取溶劑比例增大，多糖得率也逐漸變大。

在單因素實驗的基礎上進行正交試驗，結果見表2。表2極差分析結果顯示:R(提取溫度)＞R(料液比)＞R(提取時間)，發現溫度的影響最為顯著。由正交試驗結果選擇最優的提取條件為:料液比1∶25，提取溫度110℃，提取時間20 min，得率為0.515%。同時在此條件下，進行3次重復的驗證實驗，多糖得率分別為0.534%、0.512%、0.522%，表明所選擇的微波輔助提取條件基本穩定。

圖2 微波輔助提取靈芝子實體多糖單因素實驗Fig.2 Single factor experiments of microwave-assisted extraction method

表2 微波輔助提取正交試驗結果Table 2 Results of microwave-assisted extraction orthogonal tests

2.1.3 加速溶劑萃取

分別考察萃取時間和溫度對子實體多糖的得率的影響，結果見圖3。隨著萃取溫度升高，多糖得率不斷升高，在考察的水平范圍內，多糖得率沒有出現下降的趨勢，但不能肯定溫度繼續升高是否對多糖提取有負影響。故選擇提取溫度為130℃。靜態提取時間也對多糖的提取有影響，在5～15 min多糖得率持續升高，但提取時間增加到20 min時，有稍許下降，可能是由于多糖被破壞降解，也可能是存在實驗誤差。故選擇靜態提取時間為15 min。

由于儀器條件限制，且此萃取方法所需溶劑(純水)用量少，不好控制，故未能對其進行優化。故選用較優的提取條件為萃取溫度130℃，靜置15 min，提取2次，提取率為0.654%。

2.1.4 水浴回流提取

圖3 加速溶劑萃取靈芝子實體多糖單因素實驗Fig.3 Single factor experiments of accelerated solvent extraction

單因素實驗結果如圖4所示，圖4-a顯示水浴溫度與多糖得率呈現正相關關系，溫度達到90℃時，多糖得率增大明顯，而繼續升到100℃時，得率仍有增加。圖4-b表明提取時間延長，多糖得率也不斷增加。由圖4-c可知料液比對多糖得率的影響較小，隨著提取溶劑比例增加，多糖溶出有增加但是增加的幅度較小。

在上述單因素實驗基礎上進行正交試驗優化最佳條件，結果見表3。分析結果顯示:R(水浴溫度)＞R(水浴時間)＞R(料液比)，表明溫度是較關鍵的影響因素。故選擇正交試驗中最優的提取條件為:料液比1∶20，100℃，6 h，多糖提取率為 0.671%。并在此條件下，進行3次重復實驗進行驗證，結果顯示多糖得率分別為0.664%、0.678%、0.683%，說明選擇的 水浴回流提取提取條件基本穩定。

圖4 水浴回流提取靈芝子實體多糖單因素實驗Fig.4 Single factor experiments of heating reflux extraction method

表3 水浴回流提取正交試驗結果Table 3 The results of heating reflux extraction orthogonal test

以上結果表明，多糖得率大小:水浴回流提?。炯铀偃軇┹腿。境暡ㄝo助提?。疚⒉ㄝo助提取。由此可見，水浴回流提取和加速溶劑萃取的多糖得率較高，前者溫度高，能耗高，時間長，后者在高溫高壓條件下快速萃取多糖，效率高，條件溫和。而超聲波和微波的能量高，能破壞細胞壁使多糖溶出，但同時也可能會使得溶出的多糖被降解，在醇沉時被棄去，從而使得測定的多糖得率低。但比較而言，超聲波輔助提取的多糖得率相對較高，方法也更簡便實際。

2.2 不同提取方法多糖分子量分布比較

用高效體積排阻色譜法對4種方法最佳提取條件下提取得到的靈芝子實體多糖進行分子質量分布分析，其分子質量分布的情況如圖5所示。

圖5 四種不同的提取方法得到多糖的分子質量分布Fig.5 Molecular weight distribution of G.lucidum fruiting bodies polysaccharides extracted with four different extraction methods

表4顯示水浴回流提取、加速溶劑萃取以及超聲波輔助提取所得的多糖分子量大于10 kDa級分含量相差不大，分別是50.50%、51.92%及49.17%(圖5中1、2、3號圖譜)，表明3種提取方法對多糖結構的破壞均不大。而微波輔助法提取的多糖分子量大于10 kDa的級分含量相對較低(圖5中4號圖譜)，可能是因為微波對多糖結構的破壞作用相對較大。加速溶劑萃取法的提取成本較高且普及率較低，超聲波輔助法與加速溶劑萃取法的提取效果差異較小，且具有更好的實際應用性，故選用超聲波輔助法提取靈芝子實體多糖。

表4 不同提取方法提取的多糖分子質量分布Table 4 Molecular weight distribution of polysaccharides under different extraction conditions

2.3 不同來源的赤芝子實體多糖的分子量分布比較

表5顯示了超聲波輔助提取的11個赤芝子實體多糖分子量分布情況。從表5可見，其中3個子實體樣品多糖分子質量在100～1 000 kDa范圍的級分的相對含量較高，而其他子實體多糖分子質量100～1 000 kDa的級分的相對含量卻很少甚至沒有。比較不同樣品的菌株，產地等，發現菌株、栽培方式及產地等對靈芝多糖的分子質量分布都有影響。4號、5號和10號樣品分別是收集自不同地區的段木栽培的同種菌株的赤芝子實體(如圖6-a)。這3個樣品菌株來源相同，相同提取方法下得到的多糖的分子質量分布相似。1號和2號子實體是相同地區不同批次的代料栽培的赤芝子實體，兩者分子質量差異也很小，以分子質量小于10 kDa的級分為主(如圖6-b);3、6、8、9和11號子實體是不同產地的相同菌株的段木栽培的赤芝子實體，以分子質量在2～10 kDa以及10～100 kDa 2個級分為主，7號樣品的菌株與以上5種子實體不同，但多糖也以分子質量在2～10 kDa和10～100 kDa 2個級分為主。由此可見，影響靈芝多糖分子質量分布的因素較多，關系也較復雜，仍有待進一步研究。

表5 超聲波輔助提取不同的赤芝子實體多糖分子量分布Table 5 Molecular weight distributions of different G.lucidum fruiting bodies polysaccharides under ultrasonic-assisted condition

圖65 號(a)和2號(b)赤芝子實體多糖的分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of polysaccharides of sample 5(a)and sample 2(b)

3 結論

比較了4種不同的赤芝子實體多糖提取方法，綜合考慮多糖得率以及提取所得多糖的分子質量分布情況，同時結合實際生產應用的情況，選擇超聲波輔助提取法，并確定最佳條件為超聲功率250 W，70℃，超聲50 min，料液比1∶20。此外，比較了超聲輔助法提取的不同來源的赤芝子實體的多糖分子質量分布情況，發現不同菌株、不同栽培方式以及不同產地等都會對多糖分子量產生一定的影響。靈芝多糖的分子量分布作為可以簡單直接評價靈芝質量的重要指標之一，仍需要進一步深入地研究。

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