還原糖與脯氨酸固相美拉德反應模型中焦糖香成分的形成及機理*

周志磊，徐志強，周順，汪華，徐菲菲，李玥，鐘芳

1(江南大學食品學院，江蘇 無錫，214122)2(安徽中煙工業公司技術中心，安徽合肥，230088)

美拉德反應是還原糖與含氮物質(氨基酸、肽和蛋白質等)間發生的一種非酶棕色化學反應，它包括一系列復雜的反應并產生大量的香味物質和色素等成分［1-2］。美拉德反應在形成和改善食品色澤和風味中占有重要地位，美拉德反應產物具有抗氧化、金屬螯合以及生物活性［3-4］。

研究人員常使用氨基酸還原糖混合物的簡單模型代替食品來研究美拉德反應中香味物質及色素的形成［5］。美拉德反應可以在液相或者固相中進行，液相反應模型可以模擬蒸煮或者濕熱殺菌等過程中的美拉德反應，而固相反應模型代表了烘焙、燒烤以及卷煙燃燒等條件下的反應過程。在可以對比的條件下固相和液相美拉德反應的反應時間和產物數目有明顯差異，但是不同相中美拉德反應產物的形成機理基本上是一樣的［6］，這有助于人們分析一些具體產物的形成機理。

脯氨酸美拉德反應產生的燒烤特征香味對許多需要進行熱處理的食品風味有重要貢獻［7］，一些研究人員分析了脯氨酸美拉德反應中重要的香味物質［8］。但是，這些研究大多是在液相中進行的。因此本文探討了固相葡萄糖果糖與脯氨酸的美拉德反應中焦甜香香味物質的形成，并分析了它們的形成機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1水合 D-葡萄糖 (C6H12O6·H2O)、D-葡萄糖(C6H12O6)、D-果糖和 L-脯氨酸(Proline)、乙酸苯乙酯(內標)、2-糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基-2-糠醇、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、無水硫酸鈉和正構烷烴(C7～C15)為分析純，購自百靈威科技有限公司(北京，中國)。溶劑(CH2Cl2)為色譜純，購自Tedia公司(費爾菲爾德，美國)。

氣相色譜-質譜聯用儀6890-5975C，安捷倫科技有限公司;旋轉蒸發儀:R-215，瑞士Buchi公司;超聲儀KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型反應與樣品制備

取1mmol的1水合D-葡萄糖、D-葡萄糖或者D-果糖與1mmol的L-脯氨酸混合并在研缽中充分研磨。將混合物放入試管中，蓋上瓶塞后在150℃加熱10 min。待試管自然冷卻后，依次加入20 μg內標和20 mL CH2Cl2，超聲萃取15 min。用無水 Na2SO4去除水分，將提取液過濾，并減壓濃縮至1 mL進GCMS分析。每個樣品至少制備和測試2個重復。

1.2.2 氣相色譜-質譜分析

色譜條件:進樣量為1 μL，分流比5∶1。色譜柱為 HP-5MS(60 m × 0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純He，流量1.0 mL/min，進樣口溫度240℃。升溫程序為:初始溫度50℃，保持5 min，以8℃/min升至250℃，保持10 min。質譜電離能為70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35～350amu。

1.2.3 反應產物的定性和定量

先將得到的質譜與NIST 08質譜庫和標準物質(authentic compounds，AC)(對于有標樣的物質)的質譜進行比較，對揮發性成分進行初步鑒定，再使用正構烷烴的保留時間計算出各成分的線性保留指數(linear retention indices，LRI)［9］并與文獻值和標準物質(對于有標樣的物質)的結果進行比對，保留LRI偏差小于15的物質。忽略響應因子(假定都是1)和回收率(假定100%)的影響，令內標和目標物質的峰面積比等于其濃度比，對鑒定的成分進行近似定量。

1.2.4 數據統計

實驗結果用平均值±標準偏差的形式表示，不同處理的差異顯著性采用單因素方差分析測定，多重比較采用 Duncan法，顯著性水平為0.05，使用 SPSS 19.0軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 形成的揮發性成分分析

1水D-葡萄糖、D-葡萄糖及D-果糖與脯氨酸的固相美拉德反應產物鑒定結果如表1所示，共鑒定了9個揮發性成分。2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮(DDMP)是這些揮發性成分中含量最高的物質。DDMP是脯氨酸美拉德反應模型中產量最大的揮發性成分之一，也是美拉德反應尤其是2，3-烯醇化路徑的標志［10］。此外，DDMP可能是一種重要的香味物質-麥芽酚的前體物。4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、2，4-二羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(DDF)和5-羥基麥芽酚是脯氨酸美拉德反應模型產物中重要的香味物質，具有焦糖和烘焙特征香氣［7，11］;2-糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基-2-糠醇和2-環戊烯-1，4-二酮分別具有燃燒味、焦糖香、奶甜味和焦辛甜香特征氣味［12］。1-羥基-2-丙酮是糖降解的產物，可以做為糖降解反應或者焦糖化反應發生的標志物［13］。葡萄糖和果糖與脯氨酸的美拉德反應產物具有強烈的甜的焦糖香味，以上幾種具有甜香、焦糖及焙烤特征氣味的物質可能對其總體香味有重要貢獻。本文重點關注幾種有焦糖香味的物質:2-乙酰呋喃、DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚，研究反應溫度、反應物比例以及葡萄糖分子中結晶水等因素對其生成量的影響，并推測其形成機理。

表1 葡萄糖及果糖與脯氨酸在150℃加熱10 min生成的揮發性成分以及它們的氣味Table1 Formation of the volatile compounds in the reaction of glucose and fructose with proline heated at 150℃for 10 min and their odour

2.2 溫度對幾種重要焦糖風味物質生成量的影響

相對于液相美拉德反應，固相美拉德反應通常在較高的溫度下進行［5，13-14］。因此，將葡萄糖或果糖與脯氨酸的等摩爾混合物分別在150、200、250、300℃和350℃下反應10 min，考察反應溫度對幾種選定產物生成量的影響。

圖1顯示了不同溫度下4種物質的生成量。2-乙酰呋喃受溫度影響小于其他3種物質。相對于1水葡萄糖和葡萄糖，果糖與脯氨酸的反應更有利于2-乙酰呋喃的生成。葡萄糖分子中含有結晶水對2-乙酰呋喃的生成沒有明顯影響。對于DDF來說，溫度對其生成量有顯著的影響。果糖-脯氨酸、1水葡萄糖-脯氨酸及葡萄糖-脯氨酸反應體系中DDF最有利的生成溫度分別為250、200和150℃。溫度對HDMF和5-羥基麥芽酚的影響相似，二者的最大生成量都在300℃左右，這可能預示著二者有相同的前體物或者反應路徑。葡萄糖-脯氨酸混合物生成的HDMF和5-羥基麥芽酚含量要明顯高于果糖-脯氨酸和1水合葡萄糖-脯氨酸體系。說明葡萄糖相較于果糖更有利于產生HDMF和5-羥基麥芽酚，葡萄糖分子中存在結晶水會對二者的產生造成不利影響。

圖1 溫度對幾種焦糖風味物質生成量的影響Fig.1 Formation amounts of caramel-like aroma compounds in the reaction of reducing sugars with proline at different temperatures

2.3 反應物摩爾比對幾種重要焦糖風味物質生成量的影響

在固相美拉德反應模型中，還原糖和氨基酸的比例通常是 1∶1［5，15］(摩爾比或質量比)，但不同實際樣品中的反應物比例會有很大差異。本文研究了還原糖脯氨酸比例對幾種焦糖香物質生成量的影響，如圖2所示。

圖2 還原糖脯氨酸摩爾比對幾種焦糖風味物質生成量的影響(同組不同字母代表有顯著差異(P＜0.05))Figure 2 Formation amounts of caramel-like aroma compounds with different molar ratios of reducing sugar to proline

總體上看，還原糖氨基酸比例對2-乙酰呋喃的影響較小，對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的生成量影響較大。如圖2A所示，果糖脯氨酸相較于葡萄糖脯氨酸更容易受到反應物比例的影響，且還原糖脯氨酸摩爾比小于1∶1時更有利于2-乙酰呋喃的生成。還原糖脯氨酸比例對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的影響規律相似，如圖2B、圖2C及圖2D所示，當還原糖脯氨酸摩爾比小于1∶1時，3種物質的生成量較低，當還原糖脯氨酸摩爾比大于1∶1時，3種物質的生成量較高，特別是5-羥基麥芽酚，而當還原糖脯氨酸摩爾比為2∶1時，3種物質的生成量最大。葡萄糖中含有結晶水對2-乙酰呋喃、HDMF及5-羥基麥芽酚的生成產生了顯著的影響。水分對美拉德反應的影響比較復雜，其機理還不十分清楚。原因可能是結晶水在反應中揮發會消耗能量，進而影響到了某些反應路徑，結晶水的存在也可能會改變反應物及一些反應中間體的存在狀態，進而造成反應產物的顯著差異。

2.4 還原糖脯氨酸美拉德反應路徑及幾種焦糖香物質的形成機理

溫度和反應物比例對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的影響規律比較相似(圖1和圖2)，這說明三者可能有共同的前體物。葡萄糖和果糖與脯氨酸經過一系列的美拉德前期反應生成了活性中間體-去氧二羰基化合物［16］，例如 1-去氧-2，3-己二酮糖。它可以通過環化及一系列異構化后脫水形成DDMP，DDMP可以氧化生成5-羥基麥芽酚［17］。作者發現DDMP和5-羥基麥芽酚的生成量之間有很強的相關性(數據沒有給出)，這也證明了二者間的前體物-產物關系。1-去氧-2，3-己二酮糖通過異構化和脫水可以形成一種二去氧二酮糖化合物，此化合物可以轉化成DDF，DDF經過還原和脫水形成HDMF［18］。此外，一些糖裂解產物也可以反應生成HDMF，例如1-羥基-2-丙酮和2-氧代丙醛。這些產物在美拉德反應中很容易得到［8］。2-乙酰呋喃主要有2種形成路徑，一種是Amadori化合物通過Strecker降解生成，得到的2-乙酰呋喃側鏈甲基上的碳來自于氨基酸;另一條路徑中1-去氧-2，3-己二酮糖脫水形成一種二去氧己二酮糖，此化合物環化后脫2個分子水生成2-乙酰呋喃，此路徑中2-乙酰呋喃的6個碳原子全部來自于還原糖。在液相美拉德反應中，2條路徑都有發生，且第二條路徑占主要地位;而在裂解條件(固相反應)下，2-乙酰呋喃只通過第二條路徑生成［6］。

2-乙酰呋喃受溫度和反應物比例影響都比較小，這可能暗示其反應路徑和中間體比較穩定，不易受反應條件影響。而DDF受溫度的影響與還原糖種類有關。HDMF和5-羥基麥芽酚生成量隨著溫度的升高而增加，且在300℃時達到最大值。在溫度較高時，去氧二羰基化合物中間體等物質的活性較高，也更容易轉化和降解生成HDMF和5-羥基麥芽酚，但當溫度更高時，副反應增多，其生成量下降。

還原糖在美拉德反應中的消耗速度高于脯氨酸，其中一個重要原因是從還原糖和脯氨酸混合物到生成去氧二羰基化合物的反應過程中，脯氨酸實際上起催化劑的作用，其消耗速度慢于還原糖［19］。這可能是還原糖氨基酸比例影響美拉德反應產物種類和生成量的主要原因。果糖在美拉德反應中通常比葡萄糖表現出較高的反應活性［3］，但是，研究發現葡萄糖與脯氨酸反應生成的DDF、HDMF和5-羥甲基麥芽酚遠多于果糖脯氨酸混合物，在還原糖過量時這個現象更加明顯(圖2)，也就是說葡萄糖比果糖具有更高的活性。原因主要在于脯氨酸具有特殊的結構，使其具有催化醛醇縮合反應的活性，因此在美拉德反應中它可以提高葡萄糖的活性［15］。

3 結論

溫度和反應物比例對2-乙酰呋喃的生成影響較小，而對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的生成有很大影響，且影響規律類似。4種焦甜香味物質都可以由同一個前體物1-去氧-2，3-己二酮糖生成，解釋了溫度和反應物比例對DDF、HDMF和5-羥基麥芽酚的生成影響規律類似的原因。由于脯氨酸的特殊催化活性，葡萄糖比果糖表現出更高的反應活性，且葡萄糖中含有結晶水會對會上述幾種物質的生成造成不利影響。本文的研究的美拉德反應模型在固相中進行，可以為烘焙、燒烤及卷煙燃燒時焦糖香物質的生成提供參考。

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