蘋果擠壓改性水溶性膳食纖維硫酸酯化的修飾*

楊陽，陳雪峰，李蕊岑

(陜西科技大學，生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

膳食纖維被稱為第七大營養素，對人體生理功能具有重要作用。膳食纖維發揮生理功能的顯著性與水溶性膳食纖維(SDF)和水不溶性膳食纖維(IDF)比例有很大關系，為提高SDF比例，可對膳食纖維擠壓改性，通過高溫高剪切作用使部分糖苷鍵斷裂，從而使得部分IDF轉變成SDF，提高SDF構成比例。蘋果渣中含有豐富的膳食纖維，可作為提取膳食纖維的資源。

SDF的組成成分主要為果膠、半乳甘露聚糖及葡聚糖等。研究發現，對多糖進行適當結構修飾可以改善其生物活性［1］，如對某些多糖酯化修飾后，可提高其抗凝血、抗病毒、抗氧化等活性［2-4］。目前多糖的硫酸酯化方法也有多種，如氯磺酸-吡啶法，濃硫酸法，三氧化硫-吡啶法［5-6］。本研究選用氨基磺酸作為酯化劑，以硫酸基取代度(DS)為衡量指標，通過正交試驗優化了最佳酯化工藝條件，并對其產物進行紅外光譜分析，以期為蘋果渣SDF的生物活性改造技術探討新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果渣，陜西省海升果業發展股份有限公司乾縣分公司。

1.2 試劑與儀器

體積分數35%雙氧水、NaOH、體積分數95%乙醇、K2SO4、氨基磺酸、吡啶、BaCl2、明膠、NaCl等其他試劑均為分析純。

單螺桿擠壓機，實驗室自行組裝;BS323S電子天平，賽多斯科學儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;H-1850R離心機，長沙湘儀離心機器有限公司;101-1AB型電熱鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司;高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司;VECTOR22傅立葉變換紅外光譜儀，德國BRUKER公司。

1.3 樣品處理

采用高速萬能粉碎機對蘋果渣進行粉碎，控制粉碎時間為20 s。將粉碎后物料過篩，取20目蘋果渣收集備用。

1.4 蘋果渣脫色

稱取一定量20目粉碎果渣，按照1∶8(g∶mL)料液比加入蒸餾水，以3 mol/L NaOH溶液調節pH值為13.0。加入蒸餾水體積2%的H2O2，于70℃水浴條件下反應2 h，以流水沖洗將果渣洗滌至中性，70℃烘箱中干燥。

1.5 蘋果渣擠壓改性

將脫色后蘋果渣用單螺桿擠壓機進行擠壓處理，擠壓條件為:物料粒度20目，加水量為蘋果渣干重質量的40%，螺桿轉速720 r/min。經一定時間擠壓處理后，物料于50℃烘箱干燥5 h，得擠壓改性后蘋果渣，備用。

1.6 水溶性膳食纖維(SDF)提取

稱取一定量擠壓改性后蘋果渣，以1∶25(g∶mL)料液比加入蒸餾水，攪拌后于60℃水浴處理1 h，抽濾并收集濾液，加入4倍蘋果渣體積的95%乙醇提取，靜置12 h后抽濾，所得物質于70℃烘箱中干燥，即得蘋果渣SDF。

1.7 水溶性膳食纖維硫酸酯化修飾

1.7.1 硫酸根標準曲線繪制［7］

準確稱取108.75 mg K2SO4于105℃干燥至恒重，以1 mol/L HCl溶液溶解后定容至100 mL，得到0.6 mg/mL K2SO4標準溶液，分別吸取K2SO4標準溶液 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL于具塞試管中，以1mol/L HCl溶液補至0.2mL，以1 mol/L HCl溶液為空白，加入3.8 mL三氯乙酸及1 mL氯化鋇-明膠溶液，混合均勻后反應15 min，在360 nm下測定吸光度值A1，再以1 mL明膠溶液代替氯化鋇-明膠溶液繼續上述操作，得到吸光度 A2，以 SO2-4質量(mg)為橫坐標，(A1-A2)為縱坐標繪制標準曲線。

1.7.2 酯化修飾

精確稱取0.3 g擠壓改性SDF于100 mL燒杯中，加入一定量吡啶，磁力攪拌器升至所需溫度后攪拌溶解，加入一定量氨基磺酸繼續攪拌至反應結束。反應完畢后冷卻至室溫，以2.5 moL/L NaOH溶液調節至pH 7.0～7.5，將反應液移入透析袋中，用蒸餾水進行透析。透析結束后對透析液加入3倍體積的體積分數95%乙醇，靜置12 h，以10 000 r/min離心透析液15 min，去除清液，沉淀物置于70℃水浴中將乙醇揮發干凈，干燥后即得到硫酸酯化產物。得到產物以硫酸鋇比濁法對其取代度進行測定［8］。

1.7.3 反應溫度對硫酸酯化修飾取代度的影響

按照上述試驗方法，調節反應溫度為40、50、60、70、80、90 ℃，固定酯化時間為3 h，SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例為 1∶3，氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)比例為 1∶20，測定不同酯化溫度下硫酸酯化產物取代度。

1.7.4 反應時間對硫酸酯化修飾取代度的影響

按照1.7.2試驗方法，調節反應時間為1、2、3、4、5 h，固定酯化溫度為 70℃，SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例為1∶3，氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)比例為 1∶20，測定不同酯化時間下硫酸酯化產物取代度。

1.7.5 擠壓改性SDF∶氨基磺酸比例對硫酸酯化修飾取代度的影響

按照1.7.2試驗方法，調節SDF∶氨基磺酸比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，固定酯化溫度 70 ℃，反應時間 3 h，氨基磺酸:吡啶(g∶mL)比例 1∶20，測定不同擠壓改性SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例硫酸酯化產物取代度。

1.7.6 氨基磺酸：吡啶比例對硫酸酯化修飾取代度的影響

按照1.7.2試驗方法，調節氨基磺酸:吡啶比例為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，固定酯化溫度為70℃，反應時間3 h，擠壓改性SDF:氨基磺酸(g∶g)比例為1∶3，測定不同氨基磺酸:吡啶(g∶mL)比例下硫酸酯化產物取代度。

1.7.7 擠壓改性SDF硫酸酯化修飾正交試驗

在單因素實驗基礎上，選取反應溫度(A)、酯化時間(B)、SDF∶氨基磺酸(g∶g)(C)、氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)(D)為因素，以硫酸根取代度為指標確定四因素三水平正交試驗(表1)，以得到最佳酯化條件。

表1 硫酸酯化修飾正交試驗因素及水平Table 1 Sulfation modified orthogonal factors and levels

1.8 紅外光譜分析

取擠壓改性SDF及其硫酸酯化修飾樣品，研磨過100目篩后進行傅里葉紅外光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。得到紅外光譜曲線進行分析。

2 結果與分析

2.1 硫酸根標準曲線

根據1.4.2試驗方法得到硫酸根標準曲線，所得回歸方程為y=0.996x+0.006 7，R2=0.991 2，表明K2SO4在0.012～0.12 μg內線性關系良好。

2.2 反應溫度對硫酸酯化修飾取代度的影響

由圖1可以看出，70℃時，酯化度高達1.02，低于70℃時，隨著溫度升高，酯化度逐漸增大，但當溫度高于70℃時，酯化度開始下降。這可能是因為擠壓改性后的SDF在高溫及酸性環境下，部分低聚糖等發生分解，使得酯化程度降低。

圖1 反應溫度對取代度的影響Fig.1 The effect of reaction temperature on DS

2.3 反應時間對硫酸酯化修飾取代度的影響

由圖2可以看出，當其他條件一定，反應時間為3 h時，取代度最高，可達0.78，擠壓改性SDF的酯化度隨著時間的增加先升高后降低。可能是由于氨基磺酸的酸性環境導致酯化時間過長引起部分糖降解。同時酯化時間過長也會增加經濟成本，效率降低。

圖2 反應時間對取代度的影響Fig.2 The effect of reaction time on DS

2.4 SDF與氨基磺酸質量比對硫酸酯化修飾取代度的影響

由圖3可以看出，擠壓改性SDF∶氨基磺酸的比例(g∶g)影響其酯化度，在一定比例范圍內，隨著底物比例的增加，酯化度不斷增大，當比例為1∶3時，酯化度達到最大，隨后酯化度開始降低，其原因可能在于氨基磺酸對反應體系提供酸性環境，當酸性環境過大時，引起了糖的降解。

圖3 擠壓改性SDF:氨基磺酸比例(g∶g)對硫酸酯化修飾取代度的影響Fig.3 The effect of the mass ratio of extrusion modified SDF and amino acid on DS

2.5 氨基磺酸∶吡啶比例(g∶mL)對硫酸酯化修飾取代度的影響

由圖4可以看出，隨著氨基磺酸與吡啶比例增大，酯化度逐漸增大，當氨基磺酸與吡啶的料液比為1∶40時，酯化修飾結果最好，取代度達到0.81，另外吡啶由于其惡臭味及毒性，因此比例不宜過大。

圖4 氨基磺酸∶吡啶比例(g∶mL)對硫酸酯化修飾取代度的影響Fig.4 The effect of mass volume ratio of amino acid and pyridine on DS

2.6 硫酸酯化SDF正交實驗結果

以取代度(DS)為指標的方差分析顯示，4因素的影響程度依次為A＞B＞C＞D，即反應溫度＞反應時間＞SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例＞氨基磺酸∶啶(g∶mL)比例，從表2中的k1、k2、k3來看，擠壓改性SDF硫酸酯化修飾的最佳組合為 A1B2C2D2，即反應溫度60℃，反應時間3 h，擠壓改性SDF:氨基磺酸(g∶g)比例為1∶3，氨基磺酸:吡啶(g∶mL)為 1∶30，在該工藝條件下進行酯化反應取代度達到1.18。方差分析結果顯示，反應溫度F比為10.200，大于F臨界值9.000，因此因素反應溫度是顯著的。

表2 硫酸酯化修飾正交試驗結果Table 2 The results of sulfation modified orthogonal test

2.7 硫酸酯化SDF紅外光譜分析

硫酸酯化修飾前后的擠壓改性SDF紅外光譜分析結果如圖5顯示，經過酯化修飾后，1 228.62 cm-1處出現S＝O伸縮振動吸收峰，813.93 cm-1處出現C—O—SO3吸收峰。這2個峰均為硫酸基特征吸收峰，它們的出現表明硫酸基已成功結合在擠壓改性SDF上。

圖5 硫酸酯化修飾前后紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of sulfated before and after modification

3 討論

對擠壓改性后的蘋果渣SDF進行硫酸酯化修飾，在單因素試驗基礎上設計4水平3因素正交試驗，得到最佳酯化工藝參數為:反應溫度60℃，反應時間3 h，擠壓改性 SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例為1∶3，氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)為 1∶30，該條件下，取代度達到1.29。王莉等［9］采用氯磺酸-吡啶合成硫酸酯化米糠多糖，結果顯示最佳條件下合成酯化多糖取代度為1.29。張萍等［10］采用氨基磺酸-吡啶法合成赤靈芝硫酸酯化多糖，取代度達到1.21。李公斌等［11］采用氯磺酸-吡啶法合成黑木耳硫酸酯化多糖，取代度可達0.93。本研究結果與其他研究中不同種類酯化多糖的結果較為類似。紅外光譜顯示，硫酸酯化修飾后的多糖鏈中已成功引入硫酸基。對于酯化修飾后的SDF抗氧化活性、對機體免疫性及其他生物活性研究將在今后進行進一步研究。本研究選用酯化劑為氨基磺酸，該酯化劑具有不揮發、無臭味、對人體毒性極小的優點，相比常用的酯化劑如氯磺酸、三氧化硫等更為安全。

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