烏雞低聚肽鐵配合物的穩定性研究*

劉文穎，谷瑞增，林峰，魯軍，蔡木易

(中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

鐵是人體必需的微量元素之一，缺鐵性貧血是我國常見的營養素缺乏病，主要通過服用補鐵劑來防治，但常見的無機補鐵劑吸收利用率很低，并且存在不同程度的胃腸道刺激和金屬鐵銹味等缺點。多肽鐵配合物是一種新型的生物態鐵，可直接被腸黏膜細胞吸收，吸收率遠較無機鐵高，并且天然安全，無消化道刺激，是理想的補鐵劑。因此，通過酶解等手段從食物蛋白中獲得生物活性短肽與鐵配合，開發新型補鐵產品，更符合現代消費者的需求［1，2］。

目前關于肽鐵配合物的研究有一些報道，如豬血蛋白肽鐵配合物、大豆肽鐵配合物、米蛋白肽鐵配合物等［3-5］，但有關烏雞低聚肽鐵配合物的研究鮮有報道。烏雞又名烏骨雞(Gallus gallus domesticus Brisson)，是傳統的補氣養血食材。烏雞低聚肽是以烏雞蛋白為原料，經過酶解后獲得的小分子肽物質。本實驗室前期研究結果表明，烏雞低聚肽具有多種生理活性，并且具有吸收快、耗能低、易于被人體消化和吸收等特點［6-7］。以此為基礎，利用烏雞低聚肽制備肽鐵配合物，能夠多方面強化烏雞補鐵的功效。

但烏雞低聚肽鐵配合物作為食品原料，加工條件是否影響其穩定性目前尚不明確。因此，本文以烏雞為原料制備烏雞低聚肽鐵配合物，以分子量分布和鐵含量為指標，研究溫度、pH值和蛋白酶消化對烏雞低聚肽鐵配合物穩定性的影響，以期為其在食品工業中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

烏雞，市售;抗壞血酸、氯化亞鐵、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵銨、抗壞血酸、鄰菲羅啉，北京化學試劑公司，分析純;Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，諾維信生物技術有限公司;三氟乙酸，英國Alfa Aesar公司，分析純;乙腈，美國Fisher公司，色譜純。

1.1.2 儀器

FE20K型pH計，瑞士梅特勒-托利多公司;YG30噴霧干燥機，無錫市陽光干燥設備廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋，普瑞斯機械有限公司;SHZ-3循環水多用真空泵，鄭州朋來儀器有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烏雞低聚肽鐵配合物的制備

將烏雞除去內臟，用水洗凈后切塊，用絞肉機絞碎，加適量水用勻漿機勻漿。轉移到酶解罐中，用NaOH溶液調節pH值為8.5，升溫恒定至60℃后，以每克蛋白質3000單位的酶量加入Alcalase 2.4 L，酶解2 h。之后調節pH值為7.0，溫度保持60℃，以每克蛋白質2500單位的酶量加入木瓜蛋白酶，酶解2 h。酶解結束后，升溫至100℃，保持10 min，滅酶。冷卻后6 000×g離心15 min，取上清液。用截留分子量為2×106u的陶瓷膜過濾，以虹吸方法吸出中間清液，棄去上層油脂。然后用截留分子量為1 000 u的超濾膜超濾，得到分子量小于1 000 u的濾過液，將濾過液噴霧干燥，得到烏雞低聚肽干粉。

稱取8 g烏雞低聚肽干粉，溶解于200 mL蒸餾水中。加入2.0 g抗壞血酸防止Fe2+被氧化。調節pH值為5。加入2.0 g FeCl2·4H2O，于50℃下水浴反應60 min，冷卻至室溫。加入4倍體積的無水乙醇，室溫放置1 h。抽濾收集沉淀，干燥后制得海洋膠原低聚肽鐵配合物樣品，置于干燥器中保存。

1.2.2 肽鐵配合物的分子量分布測定

用孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過濾膜將樣品過濾，利用高效液相色譜儀進行凝膠過濾。流動相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;進樣體積:10 μL;流速:0.5 mL/min;檢測波長:220 nm;柱溫:30℃，利用紫外檢測器檢測，使用GPC軟件處理數據。5種肽標準品為:乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、桿菌酶(分子量1 450)、抑肽酶(分子量6 500)、細胞色素C(分子量12 500)，分別配制成0.1%(M/V)溶液，過膜后進樣，制作相對分子量校正曲線［8］。

1.2.3 肽鐵配合物指標的測定

肽鐵配合物經過不同溫度、pH值和消化方式處理后，分別取5 mL轉移至透析袋(分子質量8 000～14 000 u)中透析48 h后，測定鐵離子含量。將硫酸亞鐵銨配制成10 μg/mL鐵離子標準溶液，分別取鐵離子標準溶液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，加入10%抗壞血酸溶液2.0 mL，鄰菲羅啉溶液3.0 mL，用蒸餾水定容至50 mL。37℃下反應60 min后，測定510 nm處的吸光度。以鐵的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。然后稱取0.05 g烏雞低聚肽鐵，加入1 mL HCl溶解，配制成0.1%烏雞低聚肽鐵溶液。稱取1 mL溶液于50 mL容量瓶中，按照標準曲線步驟測定其吸光度。計算公式為:

鐵含量/% =［C×10-3/(m×V1/V0)］×100

式中:C，標準曲線上查得樣品試液相應的鐵含量，μg;m，樣品的質量，g;V1，測定時所取樣品試液的體積，mL;V0，樣品處理后的定容體積，mL。

螯合率/%=(m1/m0)×100

式中:m1為肽鐵配合物中鐵含量，mg;m0為加入反應體系中鐵的總量，mg。

得率/%=(W1/W0)×100

式中，W1為肽鐵配合物的總量，mg;W0為烏雞低聚肽與鐵鹽的總質量，mg［9］。

1.2.4 熱穩定性實驗

將樣品用蒸餾水配置成濃度為2 mg/mL的溶液，分裝至50 mL離心管中，置于水浴鍋中，分別在20、40、60、80 ℃下水浴，2 h 后冷卻至室溫，分別檢測其分子量分布和鐵含量。

1.2.5 酸堿穩定性實驗

將樣品配置成濃度為2 mg/mL的溶液，分裝至50 mL離心管中，分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調節各管pH為3、5、7、9，在37℃的水浴鍋中放置2 h，冷卻至室溫后分別檢測其分子量分布和鐵含量。

1.2.6 體外模擬胃腸道消化實驗

1.2.6.1 胃蛋白酶消化實驗

將樣品配置成濃度為2 mg/mL的溶液，將40 mL溶液置于50 mL離心管中，用1 mol/L HCl調節pH為2，在37℃的水浴鍋中預熱片刻，加入3%(E/S)胃蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50 mL離心管，沸水中滅酶活10 min，以此作為樣品消化前對照。取出后，將剩余20 mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3 h，沸水中滅酶活10 min，冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。

1.2.6.2 胰蛋白酶消化實驗

將樣品配置成濃度為2 mg/mL的溶液，將40 mL溶液置于50 mL離心管中，用1 mol/L NaOH調節pH為6.8，在37℃的水浴鍋中預熱片刻，加入3%(E/S)胰蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20 mL于另外1支50 mL離心管，沸水中滅酶活10 min，以此作為樣品消化前對照。取出后，將剩余20 mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3 h，沸水中滅酶活10 min，冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。

1.2.6.3 胃蛋白酶消化后再胰蛋白酶消化實驗

按照1.2.6.1 的方法進行胃蛋白酶消化后，用1 mol/L NaOH調節pH為6.8，在37℃的水浴鍋中預熱片刻，加入3%(E/S)胰蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20 mL于另外1支50 mL離心管，沸水中滅酶活10 min，以此作為樣品消化前對照。取出后，將剩余20 mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3 h于沸水中滅酶活10 min，冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。

1.2.7 統計學處理

實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，組間比較采用t檢驗，若P＜0.05，兩者有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 烏雞低聚肽鐵配合物的螯合率和得率

烏雞低聚肽鐵配合物的螯合率為83.92% ±0.13%，得率為41.49% ±0.14%。與方法相同的同類工藝相比［10］，螯合率與得率相對較高。本研究中心前期研究結果表明，烏雞低聚肽鐵配合物中的Fe2+與低聚肽中 NH2+以及-COO-形成了配位鍵，與烏雞低聚肽相比，物質結構發生了變化。因此，烏雞低聚肽鐵配合物是一種新型的肽鐵配合物。

2.2 烏雞低聚肽鐵配合物的熱穩定性

烏雞低聚肽鐵配合物分別在20、40、60、80℃水浴2 h之后，其分子量分布如表1所示。烏雞低聚肽鐵配合物經過不同的溫度處理后，分子量分布基本沒有變化，各個分子量區間的比例變化不超過2%，分子量小于1 000 u的總含量均在85%左右。不同溫度處理后，烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量如圖1所示。與對照相比，烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量無顯著性差異(P＞0.05)，表明烏雞低聚肽鐵配合物經過不同溫度處理后，鐵含量無變化，烏雞低聚肽鐵配合物具有較好的熱穩定性。這可能由于烏雞低聚肽僅具有蛋白質結構中的一級結構，相對比較穩定，因此對溫度作用的耐受能力強一些。包小蘭［11］對大豆肽鈣復合物的熱穩定性進行了研究，結果表明大豆肽鈣復合物對高溫加熱具有較好的穩定性，與本文結果一致。

表1 不同溫度下烏雞低聚肽鐵配合物的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of BSFP-Fe treated by different temperatures

2.3 烏雞低聚肽鐵配合物的酸堿穩定性

圖1 不同溫度下烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量(*P ＜0.05)Fig.1 Iron content of BSFP-Fe treated by different temperatures(*P ＜0.05)

烏雞低聚肽鐵配合物在pH值分別為3、5、7、9的條件下水浴2 h之后，其分子量分布如表2所示。烏雞低聚肽鐵配合物經過不同的pH值處理后，分子量分布有一定的變化，但變化不大。由表2可以看出，烏雞低聚肽鐵配合物在性條件和堿性條件下，分子量小于1 000u的總含量略有升高，但升高不超過6%。可能由于肽與鐵形成的大分子環狀結構在強酸或強堿的作用下斷裂，形成小分子的結構。烏雞低聚肽鐵配合物在pH 7的條件下，分子量小于1 000 u的總含量升高最少，總含量為86.18%。

表2 不同pH值下烏雞低聚肽鐵配合物的分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of BSFP-Fe treated by different pH values

烏雞低聚肽鐵配合物在不同pH值條件下的鐵含量如圖2所示。與對照相比，不同pH值處理下的烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量均顯著性降低(P＜0.05)。從圖2可以看出，在中性條件下，鐵含量降低較少，而在強酸強堿條件下，鐵含量降低較多，但在pH為3～9的范圍內，烏雞低聚肽鐵配合物仍然有58.4%以上的鐵含量，這表明烏雞低聚肽鐵配合物中肽與鐵的結合具有一定的穩定性。

2.4 烏雞低聚肽鐵配合物的體外消化穩定性

圖2 不同pH值下烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量(*P ＜0.05)Fig.2 Iron content of BSFP-Fe treated by different pH values(*P ＜0.05)

烏雞低聚肽鐵配合物分別經胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，其分子量分布如表3所示。烏雞低聚肽鐵配合物經過不同的消化模式處理后，分子質量分布有一定的變化，但變化不大。經過蛋白酶消化后，烏雞低聚肽鐵配合物的組分中分子量小于1 000 u的總含量略有升高，但升高不到8%，分子量小于1 000 u的總含量在85% ～93%。與未消化對照組相比，經過消化后，大于1 000 u和500～1 000 u的組分所占比例略有降低，140～500 u和小于140 u的組分所占比例略有升高。這表明分子量相對較大的肽段經過蛋白酶消化后分解成小分子量的肽段或氨基酸。包小蘭［11］研究了大豆肽鈣復合物的消化穩定性，結果表明經過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后，大豆肽鈣復合物中大分子量組分含量減少，小分子量組分含量增加，但變化不明顯，因此大豆肽鈣復合物對消化酶的降解具有一定的耐受性。

表3 不同消化方式下烏雞低聚肽鐵配合物的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of BSFP-Fe treated by different digestion modes

經過不同消化方式處理后，烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量如圖3所示。與對照相比，烏雞低聚肽鐵配合物在胃蛋白酶、胰蛋白酶分別消化作用3 h后，鐵含量分別為57.1%、50.2%，先經過胃蛋白酶消化再經過胰蛋白酶消化后，烏雞低聚肽鐵配合物仍然有37.6%的鐵含量。這說明烏雞低聚肽鐵配合物具有一定的耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。聶瑞艷等［12］考察了羅非魚魚鱗肽鈣復合物的消化穩定性，結果表明肽鈣復合物經過胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，鈣結合量降低了32%，證明其具有一定的抗消化性。

圖3 不同消化方式下烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量(*P ＜0.05)Fig.3 Iron content of BSFP-Fe treated by different digestion modes(*P ＜0.05)

從消化穩定性實驗結果可以看出，烏雞低聚肽鐵配合物的組分中分子量小于1 000u的總含量增加不到8%，但其鐵含量降低了62.4%，分子量較小的變化導致鐵含量較大的變化。烏雞低聚肽鐵配合物的酸堿穩定性實驗結果中也表明了這一點，分子量小于1 000 u的總含量增加不到6%，但鐵含量降低了41.6%。因此，烏雞低聚肽的結構可能是影響烏雞低聚肽鐵配合物中鐵含量的重要因素。

3 結論

本研究以烏雞為原料制備出烏雞低聚肽鐵配合物，并對烏雞低聚肽鐵配合物的熱穩定性、酸堿穩定性和消化穩定性進行了考察。結果表明，烏雞低聚肽鐵配合物具有良好的熱穩定性，各個分子質量區間的比例變化不超過2%，配合物的鐵含量無顯著性差異;在酸性和堿性條件下，分子質量小于1 000 u的總含量略有升高，但升高不到6%，鐵含量有所降低，但仍然有58.4%以上的鐵含量;經過蛋白酶消化后，分子量小于1 000 u的總含量略有升高，但升高不到8%，經過胃蛋白酶消化和胰蛋白酶共同消化后，仍然有37.6%的鐵含量。烏雞低聚肽鐵配合物的這些特性有利于在食品加工中的應用，并且被人體攝入后，能在體內發揮原有的生理活性。烏雞低聚肽鐵配合物可作為一種新型的生物態鐵，開發成適用于病人和特殊人群的營養與功能食品。

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