FISH檢測兩種基因在宮頸癌篩查中的價值＊

朱園園，馮定慶，沈國棟，程 民（安微醫科大學附屬省立醫院，安徽省立醫院分子醫學實驗室，合肥 230001）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率位居女性生殖系統惡性腫瘤第2位。它的發生和發展是一個長期的、多因素相關的復雜病理過程。進行定期篩查、準確發現早期病變、及時干預，則可以大大降低宮頸癌的發病率及病死率。如何提高篩查的靈敏度、特異度，優化篩查方案，便成了首當其沖的問題。人端粒酶（TERC）RNA是人端粒酶組分之一，其編碼基因人類染色體末端酶基因（hTERC）位于染色體3q26。TERC擴增預示著端粒酶活性增加，通過延長端粒、阻礙細胞凋亡導致腫瘤發生。c-MYC癌基因定位于染色體8q24，其編碼蛋白參與細胞增殖、分化與凋亡，并且涉及人類腫瘤的形成和演進。本研究通過熒光原位雜交（FISH）技術檢測hTERC和c-MYC基因在不同程度宮頸病變上皮細胞中的擴增情況，判斷兩者在宮頸癌篩查以及疾病轉歸中的預警價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料經患者知情同意，選擇2012年3～6月在本院婦產科門診就診患者1 000例作為研究對象，年齡范圍為25～64歲，有性生活史，非妊娠期、哺乳期和月經期；排除標準：已做過陰道鏡活檢者或已經治療過的病例。從健康體檢中心收集20例臨床檢查無異常，液基細胞學（TCT）和人乳頭瘤病毒檢查陰性的病例用于FISH建立閾值。

1.2 儀器與試劑宮頸TCT檢查采用廣州安必平公司全自動沉降式制片染色機進行制片。結果采用2001版國際癌癥協會推薦的TBS診斷系統分級［1］：未見上皮內病變或惡變（NILM）；非典型鱗狀細胞（ASC）；鱗狀上皮內低度病變（LSIL），包括人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染及宮頸上皮內瘤變（CIN）Ⅰ級；鱗狀上皮內高度病變（HSIL），包括CINⅡ、CINⅢ和原位鱗狀細胞癌；鱗癌（SCC）；意義不明確的不典型腺細胞（AGCUS）和腺癌（AC）。細胞學陽性是指病變為ASC及以上。基因擴增檢測試劑盒由北京金菩嘉醫療科技公司提供。hTERC探針雜交到3號染色體長臂26.3，信號為紅色，對照探針為3號染色體著絲粒探針CSP3，信號為綠色。hTERC陽性：單個間期細胞核中綠色信號不少于兩個，紅色信號超過兩個；c-MYC陽性：探針雜交到8q24，單個間期細胞核中紅色信號超過兩個為異常擴增。每100個細胞中異常擴增細胞數超過閾值為此標本陽性。

1.3 方法納入對象行常規細胞學檢查后，利用FISH技術分別檢測TCT剩余標本中hTERC和c-MYC擴增情況，再對細胞學或基因檢測陽性患者行陰道鏡檢查，在醋白、碘試驗異常區取活檢送病理檢驗。若病理診斷為正常或CINⅠ則不進行臨床治療，若為CINⅡ及以上則進行相應的臨床治療。對所有病理異常者在第3、6、12個月進行陰道鏡隨訪及TCT、hTERC、c-MYC檢查，任一指標陽性則做病理活檢，根據病理結果進行相應處理。

1.4 統計學方法采用SPSS17.0軟件，應用χ2檢驗的方法對各組數據率進行比較，用相關性分析兩基因表達關系，檢驗水準α=0.05。若同一樣本兩種基因均異常擴增則分別計入相應分組。

2 結 果

2.1 FISH正常閾值的建立FISH檢測20例正常宮頸脫落細胞標本中hTERC、c-MYC基因的表達，統計每例標本出現基因擴增的異常細胞個數，閾值=均數+3×標準差。經計算，hTERC的閾值=5.60%，c-MYC的閾值=6.0%。超過閾值為基因擴增陽性。

2.2 基因檢測結果與液基細胞學分級的關系在1 000個病例中，共檢出TCT異常者109例，陽性率10.9%。從NILM、ASCUS、LSIL、HSIL到SCC，各級別hTERC陽性率分別為2.0%、33.8%、60.0%、85.7%、100%，c-MYC陽 性 率 分 別 為0.9%、24.2%、44.0%、52.4%、100%，兩者陽性率 均隨 著TBS分級升高而增加。hTERC和c-MYC的陽性率及雙陽性率在各級別間差別均有統計學意義（χ2值分別為407.50、300.49、243.84，P＜0.05）。相關分析顯示兩者表達呈正相關性（r=0.993 5，P＜0.01）。見表1。

表1 1 000例患者hTERC和c-MYC基因在宮頸脫落細胞中的表達情況［n（%）］

2.3 基因檢測結果與組織病理學分級的關系在1 000個病例中，有871例TCT、hTERC、c-MYC三項均為陰性，僅進行常規隨訪。三項任一陽性者有129例，病理證實49例病變，其中CINⅠ21例，CINⅡ／Ⅲ24例，宮頸癌4例。（其中TCT陰性3例），80例病理陰性中有63例TCT陽性。FISH檢測發現，從宮頸炎到CINⅠ、CINⅡ／Ⅲ、SCC，hTERC陽性率分別為35.0%、66.7%、87.5%、100%，c-MYC陽 性 率 分 別 為18.8%、52.3%、62.5%、75.0%，兩者陽性率均隨著病變程度加深逐漸增高。hTERC陽性率、c-MYC陽性率及雙陽性率各組別間有統計學意義（χ2值分別為26.88、23.10、25.46，均有P＜0.05）。相關分析顯示兩者表達呈正相關性（r=0.628 4，P＜0.01）。具體見表2。

表2 129例患者在不同組織學分級中hTERC、c-MYC的異常表達情況［n（%）］

2.4 細胞學與FISH單獨或聯合應用對宮頸病變的診斷效率

由表3可以看出，細胞學診斷宮頸病變敏感性很好，但特異性過低。FISH檢測hTERC靈敏度和約登指數均優于c-MYC（79.6%∶59.2%，0.45∶0.40），但是特異性較差（65.0%∶81.3%）。與單一基因相比，如果選用兩基因同時陽性作為標準則能大大提高特異性和陽性預測值（90.0%、74.2%），但敏感度和陰性預測值最差（46.9%、73.5%），若選任一基因陽性作為篩查標準則正好相反，提高敏感度卻降低了特異性。

表3 TCT、hTERC、c-MYC單獨或聯合應用對宮頸病變的診斷效率（%）

2.5 49例宮頸病變患者隨訪情況對初次篩查出病理異常的49例患者分為未治療組（CINⅠ，21例）和治療組（CINⅡ及以上，28例）進行隨訪。治療組有2例雙陽性（2／12）CINⅢ患者在術后隨訪第3個月時仍為hTERC陽性、陰道鏡下正常，在第6個月時發現為CINⅠ（hTERC陽性），再次錐切術后隨訪才轉為完全正常。其他27例在術后第3、6、12個月檢查均完全正常。未治療組大部分患者（18／21）在隨訪至12個月時恢復正常，但是有1例hTERC+、1例雙陽性患者在第12個月仍為CINⅠ，1例雙陽性患者在第12個月進展為CINⅡ，隨后手術治療。

3 討 論

2013年美國陰道和子宮頸癌協會發布最新宮頸癌篩查異常和癌前病變處理指南，建議30～64歲女性每5年篩查一次，并且強調細胞學和人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測兩種方法聯合應用于初篩［2］。雖然HPV陽性率和陰性預測值高，但是大部分女性在感染HPV后會在一兩年內將其清除，僅有很少會導致高級別病變［3］。相對于HPV檢查來說，TCT陽性率較低，且易受主觀因素影響。本研究中共檢出TCT異常者107例，陽性率10.7%，雖然敏感度達93.9%可是準確度低，只有48.8%。分析可能是大量病例由于炎癥、感染等引起反應性增生，被認為是ASCUS，而實際上組織學正常。因此細胞學對于這種輕微的不典型增生特異性過低，可能會造成過度檢查、過度治療的問題。因此找到更準確可靠的生物標記物來判斷病變風險、指導治療顯得尤為重要。

國外學者早就發現，端粒酶激活是HPV整合入宮頸細胞后，CIN向宮頸癌轉化的關鍵步驟［4，5］。而宮頸細胞由非典型性發育異常向宮頸癌轉變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴增，通過鑒定共同擴增基因發現位于3q26上的hTERC基因最為重要，它的異常copy數增加多預示著端粒酶的激活。Obermann等［6］用HPV、MYC、TERC多色探針對370例液基細胞學樣本進行檢測，發現從正常到ASUS、LSIL到HSIL，MYC和TERC的擴增率都呈現大幅度的增加，但是對132例LSIL進行隨訪表明，消退組與進展組之間僅TERC的擴增率有明顯統計學意義，提示TERC是LSIL的主要預后指標。Costa等［7］認為hTERC異常擴增多預示著LSIL到HSIL的轉變，而myc則與CINⅡ／Ⅲ進展為宮頸癌有關，提示myc可以作為疾病進展的預后因子。本研究發現無論是細胞學或者組織學分級，兩個基因異常表達率均隨著宮頸病變級別升高而增加，不僅可以明確區分正常組與輕微病變組，在各級別病變之間差異也比較明顯，尤其是hTERC，其陽性率不僅高而且在低級別與高級別病變之間差異也比c-MYC大。這與文獻報道基本一致［8-9］。根據隨訪結果來看，86%的CINⅠ患者不進行物理或手術治療可在一年內恢復正常。就過程而言，hTERC和c-MYC雙陽性的患者比單基因陽性的患者相對恢復時間更長甚至更易進展，但是由于病例數不足，未進行統計學分析。

另外本研究發現，在人群中c-MYC基因單獨表達較少，多是伴隨著hTERC異常擴增，在CINⅡ／Ⅲ組共同表達率達到50%，統計學分析認為二者表達呈正相關性。也有文獻報道［10］c-MYC和hTERC異常擴增之間存在相關性。TERT為端粒酶的催化亞基，是端粒酶活性的關鍵調控因子，c-MYC可以結合TERT的啟動子，在轉錄水平上調hTERT表達［11］。而端粒酶需利用其RNA亞基作為模板合成端粒重復序列。因此初步推測c-MYC和hTERC共同擴增與c-MYC激活端粒酶活性有關，但是具體機制有待研究。

總之，本文認為應用FISH檢測hTERC和c-MYC這兩個基因其特異度和準確度均較好，可以大大彌補液基細胞學的不足。不過由于特異性熒光探針成本較高，臨床可以根據不同目的進行選擇性檢測，作為常規項目液基細胞學和HPV檢測的補充，應用于宮頸病變的初篩和高度病變風險的評估。

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