乳膠增強免疫比濁法測定髓過氧化物酶試劑盒性能驗證評價

高小文，孫安平，陳建華，喬永峰，孔花娟，李玲賢，陳 皎，鄭 榮，李雄海（陜西省漢中市中心醫院檢驗科 723000）

血漿髓過氧化物酶（MPO）為一種血紅素蛋白，主要來源于多形核中性粒細胞，單核細胞、巨噬細胞中亦存在。當受到炎癥刺激、白細胞激活并脫顆粒時，多形核中性粒細胞釋放MPO［1］。近年來隨著研究的深入，認為MPO水平與急性冠脈綜合征的近期預后有明顯的相關性，是急性冠脈綜合征發生的危險因素。MPO測定的方法國內外主要是酶聯免疫吸附試驗，自動化程度低，誤差大，北京九強公司在國家863計劃支持下研發的乳膠增強免疫比濁法試劑盒，實現了在全自動生化分析儀的檢測，分析精確度和準確度都大大提高。在臨床應用和課題研究中為了評價該方法試劑盒的性能指標，本文參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的評價方案，結合國內專家對性能驗證的系統設計要求［2-4］，進行了準確度驗證實驗（回收試驗）、精密度驗證實驗、臨床可報告范圍及干擾試驗的性能驗證，現將評價結果首次報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料貝克曼AU2700全自動生化分析儀及北京九強生物技術有限公司研發生產的MPO乳膠增強免疫比濁法試劑盒（批號：13-0412）；MPO的校準品為人血清基質（量值溯源至FDA方法，批號：13-0412），5個濃度水平分別是87、141、349、652、1 172ng／mL；質控品為液體，開啟即用，（批號：13-0412），人血清基質，2個濃度水平（低值／高值）。

1.2 標本來源于心血管內科住院患者早上空腹肝素鈉抗凝血標本。肝素鈉采樣管由湖南瀏陽市醫用儀具廠生產，采集的血樣1h內分離血漿，室溫22℃，標本要求無黃疸和肉眼脂血。

1.3 方法

1.3.1 準確度驗證實驗（回收試驗）［2］：取435.8、471.9、1122 ng／mL 3個已知不同高濃度MPO的肝素鈉抗凝新鮮血漿，加入到121.4、211.1、384.6ng／mL 3個已知不同低濃度MPO的新鮮血漿中，加入比例10份低濃度與1份高濃度新鮮血漿混勻，每個連續測3次，取均值計算回收率，回收率在90%～110%，結果為可接受［5］。

1.3.2 精密度驗證實驗［6-7］：依照EP15-A方案，選兩個濃度水平的質控品，用相同試劑每個每天重復測3次，連續5天，測得15個數據，計算實驗室變異系數CV%，小于廠家變異系數CV＜10%的要求，結果為可接受。

1.3.3 分析測量范圍（AMR）驗證實驗［8］按照EP6-A2文件要求，選擇MPO濃度163ng／mL和1 084ng／mL高低血漿各1份，將2份血漿按3∶1、1∶1、1∶3的比例混合，同時將163ng／mL稀釋1倍，配制成82ng／mL，產生6個不同理論水平的混合血漿（82，163，393，624，854，1084），分別重復測定3次，取均值作為實測值，以理論值和實測均值作回歸分析，計算相關系數r，回歸方程Y=aX+b，按a=1.0±0.05、r≥0.97為驗證合格標準，說明在82～1084ng／mL濃度范圍內線性關系良好。

1.3.4 干擾試驗

1.3.4.1 溶血的干擾 先測血漿的MPO值，然后人為造成溶血，離心后測血漿中血紅蛋白g／L含量，選取5個不同血紅蛋白濃度的血漿，再次測其MPO值兩次，取均值逐一計算干擾偏差。

1.3.4.2 抗壞血酸的干擾 在定值233ng／mL的MPO血漿中分別加入100、50、25、12.5、6.3g／L濃度的抗壞血酸（按9∶1的比例），混勻靜置5min，每個重復測2次，取均值逐一計算干擾偏差%。

1.3.4.3 三酰甘油的干擾 同樣在定值233ng／mL的MPO血漿中分別加入13.33、6.83、3.46、1.78、0.88mmol／L濃度的三酰甘油（按9∶1的比例），混勻靜置5min，每個重復測2次，取均值逐一計算干擾偏差%。

1.4 統計學方法采用microsoft office Excel統計分析。

2 結 果

2.1 準確度驗證實驗（回收試驗） 3個新鮮配制的高中低值混合血漿的回收率分別見下表1，結果說明回收率在95.7%～108.3%之間，均在90%～110%回收率要求的可接受范圍內。見表1。

表1 MPO 準確度驗證實驗（回收試驗）數據統計分析

2.2 精密度驗證實驗依照EP-15方案，選兩個濃度水平的質控品，用相同試劑每個每天重復測3次，連續5d，測得15個數據，計算出實驗室精密度CV為8.9%小于廠家變異系數CV＜10%的要求。

2.3 分析測量范圍（AMR）驗證實驗將6個不同水平的混合血漿測定后，把測定值（Y）和理論值（X）進行線性回歸分析，計算相關系數r=0.997，線性回歸方程為Y=1.033 X-25.092。同時各點與回歸直線的分布關系見圖1，說明在82～1 084ng／mL濃度范圍內線性關系良好。

2.4 干擾試驗

2.4.1 溶血的干擾 5個不同血紅蛋白濃度溶血的血漿，對測定MPO的干擾，計算干擾偏差結果見表2，數據顯示不同程度的標本溶血均對測定MPO造成嚴重干擾。

圖1 線性回歸分析各點與回歸直線的分布關系圖

表2 不同溶血程度對MPO測定的干擾分析偏差

2.4.2 抗壞血酸的干擾 在233ng／mL定值血漿中加入配比稀釋濃度下的抗壞血酸后，對測定MPO的干擾偏差結果見表3，結果顯示抗壞血酸對測定MPO偏差小于10%，最高達6.5%。

表3 配比稀釋濃度下抗壞血酸對MPO測定的干擾分析偏差表

2.4.3 三酰甘油的干擾 在233ng／mL定值血漿中加入配比稀釋濃度下的三酰甘油后，對測定MPO的干擾偏差結果見表4，數據顯示三酰甘油濃度在3.46mmol／L以上會造成大于10%的負偏差。

3 討 論

臨床實驗室在正式使用選購的商品試劑盒之前對廠家聲稱的相關指標要進行驗證，以保證所選用的試劑盒達到臨床實驗室要求，這也是ISO 15189在其“檢驗程序”一節中明確要求“使用經確認的程序，性能適合其預期用途”，要求臨床實驗室在選擇測定項目的試劑盒之前，須在臨床和顧客需要基礎上確定其（最低）性能。我國“醫療機構臨床實驗室管理辦法”也做出了這樣的要求，保證所選用的試劑盒達到臨床實驗室要求的臨床性能、分析性能和經濟性能等各方面的要求.確保能提供更準確反映患者真實病情的信息，指導臨床醫生的診斷。但這并不是說需要對廠家聲明的全部分析性能進行驗證。CLIA′88就明確提出臨床實驗室可只對3項主要分析性能進行驗證，即準確度、精密度和分析測量范圍（AMR）［9］。本文依據以上標準和要求，首次對MPO試劑盒進行了主要分析性能的驗證。

準確度驗證實驗，一般可采用與參考方法比較［10］、應用參考物質［11］、回收實驗、檢測配套定值質控品，與質控說明書標示的靶值范圍比較［12］以及與室間質評結果比較等方式進行。目前該項目國際上未發布參考方法，也沒有有證的參考物質，定值質控品因廠家采取的檢測系統與本次的檢測系統不同，結果存在一定的偏差，而不能簡單比較，另外，因為是新研制的項目，衛生部臨檢中心也沒有開展此項目的室間質評。同時，免疫比濁法因各廠家制備的抗體特異性差異，造成不同廠家、不同批號間有一定的誤差，本文根據實際情況采取了新鮮樣本間的回收實驗，結果比較理想，回收率在95.7%～108.3%之間，符合定量試驗回收率（100±10）%的范圍，今后如有參考方法和有證參考物質，可以對該方法的準確度進行更好的驗證。

精密度是表示測定結果中隨機誤差大小程度的指標，是定量試驗重要的評價指標，其CV值越小，重復性越好。良好的重復性是進行其他方法學驗證實驗的前提，精密度的驗證，EP15-A2精密度方案提供了評估的詳細方法［7］，此方案比其他學者［9］采用的要簡單易行，耗時短，臨床應用和報道的也多。本文驗證的實驗室精密度CV為8.9%小于廠家變異系數CV＜10%的要求。

分析測量范圍（AMR）驗證，目的是驗證檢測系統的最高檢測值和高低檢測值之間是否呈線性關系，實驗室應為每個系統建立各自的線性參數，不應直接引用廠家提供的線性范圍。CLSI EP6-A2提供了對線性驗證的指導文件，常規實驗室對商品試劑盒的線性驗證，一般只取5種濃度標本，多次重復測定，再使用一些判斷標準即可。本文按推薦標準用6種系列濃度的新鮮血漿對試劑盒的線性進行評價，結果相關系數r=0.997，線性回歸方程為Y=1.033 X-25.092。AMR與定標范圍（87～1 172ng／mL）一致，略低于廠家提供的線性范圍25～1 300ng／mL；說明線性良好。

另外，本文選取了臨床常見的溶血、抗壞血酸、三酰甘油做干擾試驗，發現不同程度的標本溶血均對測定MPO造成嚴重干擾。抗壞血酸偏差最高達6.5%，基本無干擾，三酰甘油濃度在3.46mmol／L以上會造成大于10%的負偏差，說明該方法對三酰甘油的抗干擾能力有限，這也是免疫比濁法共有的問題，因此，臨床在測定MPO時，應避免標本溶血和乳糜血，減少分析前的測量誤差。

綜上所述京九強公司研制的乳膠增強散射比濁法測定MPO，在AU2700全自動生化分析儀上的主要分析性能驗證結果符合臨床檢驗的質量要求。各實驗室對檢測系統的性能進行有效地評估，有助于提高檢測結果的準確性和可靠性。同時國內自建檢測系統較多，在性能驗證時應根據實際情況系統和合理地選擇、設計每一種定量檢測項目的驗證方案。

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