陽離子交換在線固相萃取/液相色譜—串聯質譜法檢測牛奶中14種磺胺藥物殘留

顧欣等

摘 要 建立了陽離子交換模式在線固相萃取液相色譜串聯質譜法檢測牛奶中14種磺胺藥物方法。取5 g樣品用15 mL乙腈提取和除蛋白，提取液于50 ℃氮氣吹干后，用1.00 mL 0.2%甲酸溶解，溶解液通過雙三元液相色譜用陽離子在線固相萃取柱在線富集凈化，2%氨水甲醇/0.2%甲酸（50∶50，V/V）洗脫。然后轉移至C18色譜柱上進行分離，再用串聯四級桿質譜檢測。結果表明，14種磺胺類藥物在0.1～10 μg/kg含量范圍內線性良好（r≥0.999）；方法的檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg；方法回收率在60%～90%范圍內，批內和批間相對標準偏差都小于10%。本方法較傳統固相萃取柱凈化法更簡捷、經濟和穩定。

1 引 言

固相萃取（Solid phase extraction， SPE）利用固體吸附劑吸附液體樣品中的目標化合物，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達到分離和富集目標化合物的目的。樣品中目標物質的分離和富集是色譜分析中必不可少的一部分，因此固相萃取技術作為一種傳統的前處理手段已被廣泛應用于色譜分析的各個領域。常用的固相萃取主要有分散相固相萃取和填料柱固相萃取這兩種方式[1～4]，通過這些手段可以達到去除試樣中的干擾物質，使痕量組分得到富集便于檢測和分離，保護色譜分析柱等目的。然而，傳統離線固相萃取常需繁瑣的手工操作才能完成，比色譜分離和數據處理等花費更多的時間。近年來，隨著液相色譜儀技術的迅速發展，儀器的自動化程度越來越高，樣品的前處理技術實現自動化成為了一種新趨勢。在線固相萃取技術傳統填料柱固相萃取和分散相固相萃取相比具有節省人力和耗材，提高前處理穩定性和縮短檢測時間的優勢。

磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結構的一類廣譜抗菌藥物的總稱，獸醫臨床和畜牧養殖業中被廣泛應用于預防和治療細菌感染性疾病[11，12]。但是磺胺藥會引起人過敏性反應，且可能有致癌性，其不合理使用使其在動物性食品中殘留， 引起生態環境污染，危害人類健康。針對該情況開發了各類檢測方法，其中較為常見的有酶聯免疫法，HPLC法和UPLCMS/MS法等。據文獻報道，采用酶聯免疫法快速檢測牛奶中的8種磺胺類藥物[13]，其檢測限可達5 μg/L，靈敏度較高，檢測通量大，可以用來做大規模篩查，但無法很好區分磺胺藥物種類；使用高效液相色譜法結合基質固相分散前處理法檢測牛奶中8種磺胺類藥物，其方法靈敏度可達0.05 mg/L[14]，但其分析時間較長且靈敏度偏低；有報道超高效液相色譜串聯質譜法單針進樣可在10 min內同時檢測24種磺胺類藥物[15]，其檢測靈敏度高，方法特異性好，但是前處理步驟過于簡單，在檢測大量樣品時容易造成雜質對分析柱和質譜源區的污染。為保障目前市售牛奶的食品質量安全，防止磺胺類抗菌藥在奶牛養殖環節的違法濫用，本實驗采用在線固相萃取結合液質聯用技術檢測牛奶中14種常見磺胺類藥物， 利用雙三元液相的程序控制流路切換功能實現了在線固相萃取，解決了牛奶基質中乳脂和蛋白對儀器的干擾和污染；克服了使用傳統固相萃取技術帶來的耗材成本高，人力耗費大等缺點；提高了檢測通量和穩定性，具有更簡捷、經濟和穩定的特點。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

實驗表明，當源電壓設為3500 kV時，大部分磺胺類化合物的[M+H＼]+分子離子峰絕對響應達到最大值；之后，隨著源電壓上升，響應沒有顯著增加；到3800 kV之后甚至有下降趨勢，且源區有微弱電弧光顯現。推測可能是電壓太高而造成霧化后的微液滴電荷過載，發生擊穿放電現象，此現象導致進入離子傳輸通道的帶電粒子數下降。因此，源電壓選擇3500 kV。另外，在被檢測的化合物中，SPD與SDZ分子離子的質荷比僅差1，SMZ與ST之間，SBZ與SDMD與SMPD之間的質荷比僅差2，因此有必要提高Q1段的質量數分辨率，避免相互之間的干擾。將Q1段的質量數分辨率從原來的半峰寬0.7提高到0.4，這樣可能會損失一定的響應值，但是可以很好地解決質量數接近的分子離子互相干擾問題，有效提高信噪比。

3.2 在線固相萃取條件的優化

在線固相萃取（Online SPE）是通過控制兩臺獨立工作的液體傳輸泵和切換閥使用程序分別進行檢品的富集凈化和分析，需要有一臺泵負責進樣和富集凈化功能，使目標化合物在在線固相萃取柱上實現保留富集和洗滌；通過閥切換，使用另一臺泵進行樣品的過柱分離和檢測。選擇合適的在線固相萃取柱和設計合理的富集凈化和洗脫條件是在線固相萃取方法的關鍵，本方法選擇Retain CX作為在線SPE柱，Retain CX的富集凈化機理為陽離子交換結合反相機理，磺胺類藥物大多為堿性化合物，使用陽離子交換結合反相模式的在線固相萃取柱具有更好的富集凈化效果。在進樣時進樣泵的流路采用甲醇0.2%甲酸（10∶90， V/V）為流動相，可在富集磺胺類藥物的同時清洗部分極性較大的雜質，通過在線分析柱后直接連接質譜檢測器，發現采用此流動相并無目標化合物的流失（圖2a）。選擇5%氨水甲醇溶液作為洗脫液，通過閥切換，使用分析流路進行洗脫和分析，分析流路應在閥切換之前先用洗脫溶液充滿流路，這將有助于更快地在閥切換之后集中將目標化合物洗脫，避免因為分析流動相造成在線凈化柱上目標化合物的擴散而造成目標峰展寬。將流路中的分析柱拆去，用兩通替代，可以獲得目標化合物的洗脫時間約為4.2 min（圖2b）。據此可以確定，閥切換的時間應該略晚于此時間，但不應過長而導致部分低極性雜質進入分析流路。由于5%氨水甲醇洗脫劑和0.2%甲酸乙睛（15∶85， V/V）分析流動相的差異較大，容易由于溶劑化效應而造成色譜峰展寬，因此洗脫時采用較低的流速0.4 mL/min， 減小進樣溶劑的總量；此時分析流路使用較高流速3.3 檢測限和定量限的測定

選擇20個空白樣品，按優化條件進行處理后上機測定，取與標準品圖譜中相同保留時間的噪音信號平均值，以信噪比S/N≥3為檢出限（LOD）， S/N≥10為定量下限（LOQ），確定該方法對鹽酸賽庚啶的檢出限為0.05 μg/kg，定量下限為0.1 μg/kg。經過實際進樣檢測后，檢測定量限附近峰型良好。

3.4 在線固相萃取與傳統固相萃取方法檢測14種磺胺類藥物的回收率與精密度比較

為研究在線固相萃取和傳統固相萃取法檢測牛奶種14種磺胺類藥物時方法回收率和精密度的差異，使用6批不同牛奶，每批稱取等量6份，3份一組分兩組，分別加入0.1，0.5 和5.0 μg/kg的14種磺胺類化合物，兩組分別采用在線陽離子交換固相萃取法和傳統陽離子交換固相萃取法，所得結果如表4所示。實驗結果表明，在線陽離子交換固相萃取法檢測牛奶中14種磺胺類化合物時回收率結果在60%～90%之間，在線陽離子交換固相萃取法與傳統陽離子交換固相萃取法的批內和批間相對標準偏差也都在0～10%之間，所得結果基本一致，且具有簡捷、經濟和穩定的優點。

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Determination of 14 Sulfonamides Residue in Milk by Online

Solid Phase Extraction in Cation Exchange Mode/Liquid

ChromatographyTandem Mass Spectrometry

GU Xin， WU JianPing*， ZHANG Xing， LI DanNi， YAN Feng， ZHOU YueRong

（Shanghai Municipal Supervisory Institute of Veterinary Drugs and Feedstaff， Shanghai 201103， China）

Abstract To determine the residue of 14 sulfonamides in milk， a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） method with online soild phase extraction （SPE） in cation exchange mode was established. 5 g of milk was extracted with 15 mL acetonitrile. Then the extraction was evaporated by 50 ℃ nitrogen and dissolved by 1.00 mL 0.2% formic acid. The dissolution was enriched and purified by MS/MS cation exchange online SPE column on a double ternary liquid chromatography， and eluted by the mixed solution of 2% ammonia methanol and 0.2% formic acid （50∶ 50， V/V）. The compounds were separated by an octadecyl silica bonded column and determined by the tandem mass spectrometry. The results showed that the linearity of 14 sulfonamides was good in the range of 0.1–10 μg/kg （r≥0.9995）. The LOD of the method was 0.05 μg/kg， while the LOQ was 0.1 μg/kg. The recoveries of the 14 sulfonamides were in the range of 60 %-90 %， while the interbatch and intrabatch RSDs were all lower than 10%. The method was proved to be more convenient， economical and stable than the traditional SPE column method.

Keywords Online solid phase extraction； Cation exchange； Double ternary liquid chromatographytandem mass spectrometry； Sulfonamides； Milk

（Received 25 August 2014； accepted 10 October 2014）

This work was supported by the Special Fund for Agroscientific Research in the Public Interest （No. 201203023）

GU Xin， WU JianPing*， ZHANG Xing， LI DanNi， YAN Feng， ZHOU YueRong

（Shanghai Municipal Supervisory Institute of Veterinary Drugs and Feedstaff， Shanghai 201103， China）

Abstract To determine the residue of 14 sulfonamides in milk， a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） method with online soild phase extraction （SPE） in cation exchange mode was established. 5 g of milk was extracted with 15 mL acetonitrile. Then the extraction was evaporated by 50 ℃ nitrogen and dissolved by 1.00 mL 0.2% formic acid. The dissolution was enriched and purified by MS/MS cation exchange online SPE column on a double ternary liquid chromatography， and eluted by the mixed solution of 2% ammonia methanol and 0.2% formic acid （50∶ 50， V/V）. The compounds were separated by an octadecyl silica bonded column and determined by the tandem mass spectrometry. The results showed that the linearity of 14 sulfonamides was good in the range of 0.1–10 μg/kg （r≥0.9995）. The LOD of the method was 0.05 μg/kg， while the LOQ was 0.1 μg/kg. The recoveries of the 14 sulfonamides were in the range of 60 %-90 %， while the interbatch and intrabatch RSDs were all lower than 10%. The method was proved to be more convenient， economical and stable than the traditional SPE column method.

Keywords Online solid phase extraction； Cation exchange； Double ternary liquid chromatographytandem mass spectrometry； Sulfonamides； Milk

（Received 25 August 2014； accepted 10 October 2014）

This work was supported by the Special Fund for Agroscientific Research in the Public Interest （No. 201203023）

GU Xin， WU JianPing*， ZHANG Xing， LI DanNi， YAN Feng， ZHOU YueRong

（Shanghai Municipal Supervisory Institute of Veterinary Drugs and Feedstaff， Shanghai 201103， China）

Abstract To determine the residue of 14 sulfonamides in milk， a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） method with online soild phase extraction （SPE） in cation exchange mode was established. 5 g of milk was extracted with 15 mL acetonitrile. Then the extraction was evaporated by 50 ℃ nitrogen and dissolved by 1.00 mL 0.2% formic acid. The dissolution was enriched and purified by MS/MS cation exchange online SPE column on a double ternary liquid chromatography， and eluted by the mixed solution of 2% ammonia methanol and 0.2% formic acid （50∶ 50， V/V）. The compounds were separated by an octadecyl silica bonded column and determined by the tandem mass spectrometry. The results showed that the linearity of 14 sulfonamides was good in the range of 0.1–10 μg/kg （r≥0.9995）. The LOD of the method was 0.05 μg/kg， while the LOQ was 0.1 μg/kg. The recoveries of the 14 sulfonamides were in the range of 60 %-90 %， while the interbatch and intrabatch RSDs were all lower than 10%. The method was proved to be more convenient， economical and stable than the traditional SPE column method.

Keywords Online solid phase extraction； Cation exchange； Double ternary liquid chromatographytandem mass spectrometry； Sulfonamides； Milk

（Received 25 August 2014； accepted 10 October 2014）

This work was supported by the Special Fund for Agroscientific Research in the Public Interest （No. 201203023）