超聲波輔助溶菌酶酶解提取地木耳蛋白質工藝優化

李 讓 魯 軍 陳劍婷 袁 悅 田 漫 任迪峰

（1.北京林業大學生物科學與技術學院食品系北京市林業食品加工與安全重點實驗室，北京 100083；2.中國食品發酵工業研究院北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015）

地木耳（Nostoccommune）又名地皮菜、葛仙米、地耳等，屬原核生物界、藍藻門、念珠藻屬的單細胞陸生固氮藍藻，是一種高蛋白、低脂肪的綠色食品，蛋白質含量一般占干重的14.6%～21.81%，是很好的蛋白質來源［1－3］。其組分中的藻藍蛋白（PC），不僅可作為食品著色劑和熒光探針，同時對于自由基的清除和特異性免疫功能的提高也有促進作用，有較大的應用價值［4，5］。地木耳蛋白質中氨基酸結構比例與人體需要量相近，長期食用可提高機體免疫力［6，7］。傳統的地木耳蛋白質提取方法主要有溶劑法和堿法，但因存在提取溶劑不易去除、提取率低和生產成本較高等缺點［8－10］，使得地木耳中的蛋白質尚未被充分開發利用。

從顯微結構看，地木耳部分藻絲存在膠鞘包裹、細胞壁成分復雜、破壁難度較大［11］等問題。而地木耳中蛋白質主要存在于胞內，因此提取關鍵技術在于破壁［5］。有研究［12］采用溶菌酶添加少量纖維素酶和果膠酶進行原核藻類處理，破壁效果較好。同時一些蛋白質或多糖提取的研究［13－15］表明，采用酶解方法，再結合反復凍融溫和破壁，可避免高溫對原料造成營養損失等不良影響。另有研究［16－21］采用超聲波輔助處理藻類或其他植物原料，利用其產生的空化及機械作用加速細胞壁的破碎，促進蛋白質溶出，提高蛋白質提取效率。

基于以上眾多研究成果可以發現，整合酶解、凍融以及超聲波輔助法進行植物原料的細胞破碎將是一種很好的地木耳蛋白質提取優化思路。本研究擬以蛋白質提取率為指標，結合酶解、凍融和超聲波法進行細胞破碎，探究地木耳蛋白質的提取條件，并通過響應面法對提取參數進行優化，旨在為地木耳蛋白質的進一步開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

地木耳片：山西汾陽市迅達土特產品有限責任公司；

牛血清白蛋白（BSA）：生物試劑，美國Amresco公司；

考馬氏亮藍G-250：生物試劑，天津市博迪化工有限公司；

果膠酶：活力單位＞10kU/g solid，上海伊卡生物技術有限公司；

纖維素酶：活力單位為10kU/g solid，上海伊卡生物技術有限公司；

溶菌酶：活力單位＞20kU/mg，上海前塵生物科技有限公司；

液氮：中科院半導體研究所；

磷酸、乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

凱氏定氮儀：KDY-9830型，北京市通潤源機電技術有限責任公司；

超聲波細胞粉碎機：JAC-IV型，濟寧市奧波超聲波電氣有限公司；

低速離心機：LD4-2型，北京醫用離心機廠；

數顯溫控儀：XMTB型，余姚市東方電工儀器廠；

紫外可見分光光度計：725型，上海美譜達儀器有限公司；

臺式恒溫振蕩器：TS-100B型，上海天呈實驗儀器制造有限公司；

電子天平：FA2004-N型，上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 地木耳蛋白質提取工藝

地木耳干片→粉碎→80目過篩→稱量→料液混勻→液氮凍融→組合酶酶解（0.1%溶菌酶、0.05%纖維素酶、0.05%果膠酶，55℃酶解1h）→滅酶（80℃，15min）→超聲波處理→離心分離（4 000r/min，15min）→測定蛋白質提取率

1.3.2 地木耳總蛋白含量的測定 根據GB 5009.5—2010，采用微量凱氏定氮法測定地木耳蛋白質的總量。

1.3.3 地木耳的可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍G-250蛋白質染色法在595nm處測定可溶性蛋白質含量［22］。按式（1）計算可溶性蛋白質提取率：

1.3.4 超聲波破碎條件單因素試驗設計

（1）時間對地木耳蛋白質提取率的影響：料液比為1∶30（m∶V），超聲功率600W，超聲時間分別為10，15，20，25，30min，以可溶性蛋白質的提取率為指標，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質的提取率。

（2）功率對地木耳蛋白質提取率的影響：料液比為1∶30（m∶V），超聲時間25min，超聲功率分別為200，400，600，800，1 000W，以可溶性蛋白質的提取率為指標，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質的提取率。

（3）料液比對地木耳蛋白質提取率的影響：超聲功率為800W，超聲時間25min，料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（m∶V）。以可溶性蛋白質的提取率為指標，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質的提取率。

1.3.5 數據分析方法 利用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數據進行處理，獲得數學模型，對響應值進行回歸分析、方差分析，用F檢驗判定回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性，得出超聲波各因素對蛋白質提取率的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 提取時間對蛋白質含量的影響 由圖1可知，在2 5min前，隨著時間的延長，溶液中的可溶性蛋白含量不斷增加，說明地木耳細胞壁在超聲波的反復作用下出現明顯破損，細胞內蛋白質被釋放出來，蛋白質肽鏈間被破壞的二硫鍵的量不斷增大，直到2 5min時，達到飽和；當提取時間超過25min后，溶液中蛋白質含量呈現降低的趨勢，這可能是因為隨著時間的延長，產生的熱量過多，導致蛋白質的穩定性降低，引起蛋白質分解。綜上分析可得，較佳的提取時間為25min。

圖1 提取時間對蛋白提取率的影響Figure 1 Effect of extraction time on protein content

2.1.2 提取功率對蛋白質含量的影響 由圖2可知，在8 00W前，隨著提取功率的增長，超聲波振動空化、機械粉碎、攪拌等作用，使組織中的細胞破裂，利于溶劑滲透到細胞內，蛋白質含量逐漸增加。當提取功率超過8 00W，由于超聲提取功率過大，溫度迅速升高會破壞蛋白質，從而影響蛋白質提取率，使得溶液中蛋白質含量逐漸降低。綜上可得，較佳的提取功率為800W。

圖2 超聲功率對蛋白質提取率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic power on protein content

2.1.3 料液比的影響 料液比越大，即溶劑體積越大，則溶劑中可以容納的有效成分越多。料液比對蛋白質提取的影響見圖3，當料液比達到1∶40（m∶V）時，蛋白質含量不再繼續提高，說明此時地木耳蛋白質中肽鏈間被破壞的二硫鍵的量達到最大。再增加水量，不能顯著破壞肽鏈間的二硫鍵，溶液中蛋白質含量無明顯變化，隨著所加水量增加到一定程度，濃度過小使得摩擦破碎不完全，蛋白質濃度反而降低［23］。由圖3可知，料液比1∶40（m∶V）為最佳條件。

圖3 料液比對蛋白質提取率的影響Figure 3 Effect of ratio of material to liquid on protein content

2.2 響應面優化試驗的設計與結果分析

2.2.1 響應面優化試驗的設計 根據單因素試驗結果，選取時間、功率和料液比3個因素作試驗因素，以蛋白質提取率為響應值，借助Design-Expert 8.0.5Trial軟件對提取條件進行分析優化，試驗因素及水平見表1。

2.2.2 地木耳優化試驗設計及結果 地木耳優化試驗設計及結果見表2。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

表2 地木耳提取優化試驗設計及結果Table 2 Optimization of fermentation conditions design and results of experimental design

2.2.3 模型的建立與顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.5統計軟件進行試驗數據二次多項回歸擬合，獲得蛋白質提取率（Y）對自變量時間、功率、料液比的多元回歸方程：

對該模型進行顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，模型P＜0.01，失擬項P＝0.620 7＞0.05，說明該模型極顯著，失擬項不顯著，殘差主要由隨機誤差引起；同時復相關系數R2＝0.927 8，Radj2＝0.834 9，說明該模型對試驗的擬合情況良好，自變量與響應值之間線性關系顯著。由此可得，應用該回歸方程分析和預測試驗結果具有可行性［24］。

分析表3可得出，交互項AB、BC與二次項A2、C2均達到顯著水平（P＜0.05）。另外，通過F值的大小，可以推斷在選定的試驗范圍內各因素對試驗結果的重要性，F值越大，其重要性越大［25］，在所選的各因素范圍內，各因素對結果的影響大小順序為：功率＞時間＞料液比。

2.2.4 最優酶解參數的確定 Design-expert 8.0.5軟件的響應面優化設計分析優化結果見圖4～6。

表3 試驗結果方差分析表Table 3 Test result of regression analysis

圖4 提取時間超聲功率對地木耳蛋白質提取率影響的響應面圖Figure 4 The response surface figure about the effect of extraction time and ultrasonic poweron protein content

圖5 超聲功率料液比對地木耳蛋白質提取率影響的響應面圖Figure 5 The response surface figure about the effect of ultrasonic power and ratio of material to liquid on protein content

圖6 提取時間料液比對地木耳蛋白質提取率影響的響應面圖Figure 6 The response surface figure about the effect extraction time and ratio of material to liquid on protein content

由圖4可知，料液比固定在零水平的條件下，蛋白質的提取率隨時間的增大先提高后降低。前期地木耳蛋白質提取率的增加可能是因為超聲波一旦與體系組分接觸，即刻產生空化效應，地木耳細胞壁得到充分破碎，從而使得蛋白質分子的溶出能力增加。而超聲時間和超聲功率增加到一定的數值時，蛋白質的某些次級鍵受到破壞而變性，從而使得蛋白質的溶解度下降。此等高線是橢圓型的，但是并不密集，可說明超聲時間和超聲功率交互作用顯著。

由圖5可知，時間固定在零水平的條件下，增加料液比會使蛋白質的提取率先增加后降低，增加超聲功率使提取率緩慢增加。等高線逐漸靠近并呈現橢圓，這說明料液比和功率的交互作用顯著。由圖6可知，功率固定在零水平的條件下，地木耳蛋白質提取率隨著料液比和超聲時間的增加呈現的是先增加后降低的趨勢，并且料液比增加的幅度大于超聲時間增加引起的幅度。料液比過大，會使得溶液濃度過小，超聲產生的機械作用不能均勻地作用于地木耳細胞，表現為蛋白質提取率的降低。二者等高線是圓形的，可說明超聲時間和料液比交互作用并不明顯。

2.2.5 最佳提取工藝的確定及模型驗證 借助分析軟件可直接得出最優提取工藝為：時間27.49min、功率1 000W、料液比1∶41.93（m∶V），最佳提取率為17.85%。但從試驗的可行性考慮，將最優工藝調整為：時間27.5min、功率1 000W、料液比1∶42（m∶V）。為了驗證響應面法所得結果的準確性，進行3次平行驗證實驗，所得實際蛋白質平均提取率為17.24%，相對偏差3.41%。由此可說明，響應面法所優化的總蛋白提取條件與實際試驗結果相近，參考作用與試驗價值較高。

3 結論

本試驗采用酶解、凍融及超聲法聯合處理地木耳材料的方法，并對影響地木耳蛋白質提取率的因素：時間、功率及料液比進行了研究，在此基礎上利用Box-Behnken試驗設計方案和響應面分析建立了回歸方程。由F檢驗得到因子貢獻率為功率＞時間＞料液比。通過Box-Behnken設計響應面法建立三因素三水平的響應面分析試驗，得到最優條件為：時間27.5min、功率1 000W和料液比1∶42（m∶V），此工藝下的提取率為17.24%，通過驗證實驗，證實了該模型的可行性，對地木耳蛋白的進一步開發利用提供了良好的基礎。本研究下一步擬在抗氧化活性等方面對本法提取的地木耳蛋白質進行探究，以期為地木耳蛋白質在功能性食品開發等應用中起到推動作用。

1 Kaj Sand-Jensen，Thomas Sand Jespersen.Tolerance of the wide spread cyanobacteriumNostoccommuneto extreme temperature variations（－269to 105℃），pH and salt stress［J］.Physiological Ecology-original Research，2012，169（2）：331～339.

2 Kohji Hori，Genji Ishibashi，TakuoOkita.Hypocholesterolemic effect of blue-green alga，ishikurage（Nostoccommune） in rats fed atherogenic diet［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1994，45（1）：63～70.

3 Kohji Hori，Tomoko Ueno-Mohri，Takuo Okita，et al.Chemical composition，in vitro protein digestibility and in vitro availableiron of blue green alga，Nostoccommune［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1990，40（1）：223～229.

4 岳思君，賈士儒，丁文杰，等.發狀念珠藻藻藍蛋白分離純化及性質研究［J］.食品與發酵工業，2011，31（9）：1～6.

5 王瑤.地皮菜的人工液體培養及其藻藍蛋白的分離純化［D］.西安：西北大學，2012.

6 Donna R Hill，Thomas W Keenan，Richard F Helm，et al.Extracellular polysaccharide ofNostoccommune（Cyanobacteria）inhibits fusion of membrane vesicles during desiccation［J］.Journal of Applied Phycology，1997，9（3）：237～248.

7 Heather E Rasmussen，Kara R Blobaum，Elliot D Jesch，et al.Hypocholesterolemic effect ofNostoccommunevar.sphaeroides Kützing，an edible blue-green alga［J］.European Journal of Nutrition，2009，48（7）：387～394.

8 謝姣.超聲波輔助堿法提取紅橘種子蛋白質的研究［J］.山東食品發酵，2012（2）：17～20.

9 劉曉庚，高梅，陳梅梅，等.多酶法提取高溫菜籽粕中蛋白質的工藝及其優化［J］.中國糧油學報，2012，27（8）：69～72.

10 袁保紅，杜青平.地木耳蛋白質提取工藝及其穩定性的研究［J］.食品研究與開發，2007，28（4）：117～120.

11 閻春蘭，鄧中洋，胡征宇.人工培養地木耳的群體顯微結構及營養成分分析［J］.食品科學，2010，31（3）：22～25.

12 章軍，徐虹，蔡暉，等.絲狀藍藻Calothrix sp.PCC7601原生質球的分離和再生［J］.廈門大學學報：自然科學版，2000，39（3）：381～385.

13 崔素萍，張洪微，左豫虎，等.凍融和超聲波處理提高大米蛋白質提取率初報［J］.食品科學，2008，24（2）：98～100.

14 郭衛蕓，杜冰，袁根良，等.反復凍融法破壁啤酒廢酵母的研究［J］.釀酒科技，2009（3）：103～105.

15 張雅利，梁花香，曹娜.提取方法對柿多糖提取率及生物活性的影響［J］.食品與生物技術學報，2008，27（6）：18～22.

16 曾婷婷，明生艷.超聲波法提取河蜆糖蛋白［J］.江西農業大學學報，2008，30（1）：144～148.

17 周泉城，申德超，區穎剛.超聲波輔助提取經膨化大豆粕中低聚糖工藝［J］.農業工程學報，2008，24（5）：245～248.

18 魏文志，付立霞，陳國宏.基于凍融輔助超聲波法的小球藻多糖提取工藝優化［J］.農業工程學報，2012，28（16）：270～274.

19 馬秀婷，肖志剛，孫旭，等.超聲波輔助提取豆渣蛋白工藝優化［J］.食品與機械，2013，29（1）：108～112.

20 貫云娜，吳昊，楊紹蘭，等.超聲復合酶法提取大蒜多糖的工藝優化［J］.食品與機械，2014，30（1）：199～204.

21 賴紅芳，黃秀香，陸俊宇.超聲波輔助提取山豆根中的黃酮和多糖工藝優化［J］.食品與機械，2014，30（1）：196～223.

22 柳蔭，吳鳳智，陳龍，等.考馬斯亮藍法測定核桃水溶性蛋白含量的研究［J］.中國釀造，2013，32（12）：131～133.

23 趙源，劉愛國，吳子健，等.谷朊粉中麥谷蛋白的堿法提取工藝優化［J］.食品與機械，2014，30（1）：220～223.

24 霍丹群，王洪彬，宋興興，等.響應面法優化獼猴桃原酒發酵工藝［J］.食品工業科技，2013，34（9）：219～223.

25 樊志勇，孫亮，朱瑞倩，等.響應面法優化液態復合酶制備香蕉汁工藝條件研究［J］.食品工業科技，2013，34（20）：203～207.