鵝肉發酵香腸菌種發酵性能與應用研究

王志威 吳素娟 李先保

（安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100）

WANG Zhi-wei WU Su-juanLI Xian-bao

鵝肉發酵香腸是指將鵝肉、豬背脂絞碎，加入鹽、糖、發酵菌種及香辛料等輔料，均勻混合后灌進腸衣，經過微生物發酵而制成的風味獨特、香味濃郁的發酵肉制品［1］。生產鵝肉發酵香腸的關鍵工藝是發酵劑的篩選和使用，發酵劑不僅保證了最終發酵成品的質量安全性和穩定性，而且決定了香腸的獨特風味［2］。Maijala等［3］的研究結果表明，制備西式發酵香腸時，采用乳酸桿菌和微球菌混合發酵的效果比采用單一乳酸桿菌的好。中式發酵香腸若采用混合發酵菌種，生產出的產品其風味也更優［4］。此外，不同發酵劑對內源菌群的影響作用不一致，一些發酵劑在發酵過程中會產生細菌素，通常可以抑制與之相似的微生物［5］。有研究［6］認為，2種乳酸菌混合培養過程中產生的細菌素，導致其互相抑制，影響香腸的發酵效果。

本研究在吸收西式發酵肉制品技術的基礎上，擬通過對植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、戊糖片球菌3種菌種的發酵性能分析，選出2種符合鵝肉發酵香腸發酵的發酵劑，并通過正交試驗確定復合發酵劑的最優配比，從而制備出外觀、組織狀態、風味較好的鵝肉香腸，并對鵝肉發酵香腸成熟過程和貯藏過程中的pH值和感官品質等方面進行綜合分析。旨在為肉鵝養殖及深加工技術的產業化提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 原輔料

鵝肉、豬肉肥膘、白胡椒粉、味精、五香粉、淀粉：鳳陽市售；

乙醇、NaNO2、NaCl、Vc、蔗糖、葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

木瓜蛋白酶：20萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

嗜酸 乳 桿 菌 （Lactobacillusacidophilus，La）：編 號11073，中科院微生物所提供；

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum，Lp）：編號11016，中科院微生物所提供；

戊糖 片 球 菌 （Pediococcuspentosaceus，Pp）：編 號CICC23189，中科院微生物所提供；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：安徽科技學院食品藥品學院微生物實驗室提供；

無菌生理鹽水（用于對菌種凍干粉的活化）：稱取8.5g氯化鈉加入到1 000mL蒸餾水中，在121℃下高壓滅菌1 5min；

MRS固體培養基［7］（用于菌種的培養和乳酸菌總數測定）：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，乙酸鈉5g，檸檬酸二銨1.5g，葡萄糖2 0g，吐溫80lmL，MgSO4·7H2O 0.6g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL，pH 值6.2～6.4；

MRS液體培養基［8］：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，乙酸鈉5g，檸檬酸二銨1.5g，葡萄糖2 0g，吐溫80lmL，MgSO4·7H2O 0.6g，蒸餾水1 000mL，pH值6.2～6.8。

1.2 儀器與設備

精密pH酸度計：PHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司；

斬拌機：CH-3508型，常熟凱博不銹鋼設備制造有限公司；

絞肉機：M12S型，沈陽厚地實業有限公司；

電子精密天平：JA61001型，上海精密科學儀器有限公司；

電熱恒溫培養箱：HH.B11600型，上海躍進醫療器械廠；

分析天平：FA2104N型，上海躍進醫療器械廠；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：SYQ-DSX-280B型，上海申安醫療機械廠；

可見分光光度計：V-5000型，上海元析儀器有限公司；

立式壓力蒸汽殺菌鍋：LS-B0L型，科大創新股份有限公司；

低速離心機：KDC-40型，科大創新股份中佳分公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化 植物乳桿菌的活化［9］：在無菌條件下，用接種環將凍干粉菌種接種于滅菌后的MRS斜面培養上，在37℃下培養48h；用斜面上長出的菌種接種于MRS培養基上，于37℃培養48h；再次重復操作，直到長出的菌種生長良好為止，完成菌種的活化。戊糖片球菌和嗜酸乳桿菌的活化方法同植物乳桿菌。

1.3.2 菌種發酵性能測定

（1）耐食鹽能力的測定：采用添加了0，2，4，6，8g/L NaCl的液體MRS培養基，分別接入Lp、La、Pp 3種菌種，于3 6℃恒溫培養24h，600nm波長處測定相應的吸光度值［10］。

（2）耐亞硝酸鹽能力的測定：將3種菌種分別接種到添加有0，50，100，150mg/kg亞硝酸鹽含量的液體 MRS培養基，于3 6℃恒溫培養24h，600nm波長處測定吸光度值，以判斷3種菌種的存活情況［6］。

（3）產粘性的測定：用10g/L蔗糖代替葡萄糖制作MRS固體培養基，將植物乳桿菌、戊糖片球菌和嗜酸乳桿菌3種菌種分別接種于該培養基上，同時作為對比，將這3種菌種分別接種于含有10g/L葡萄糖的 MRS培養基上，于3 6℃恒溫培養24h，用接種針挑起菌落直接觀察其產粘性［11］。

（4）拮抗性的測定：在固體MRS培養基上對其中一種菌種進行劃線接種，于3 6℃恒溫培養24h，觀察菌落生長情況，并測出其菌落總數。

（5）蛋白質降解能力的測定：將1mL菌懸液涂布于加有15%脫脂乳的MRS固體培養基中，于3 6℃恒溫培養2 4h，通過菌落周圍的透明圈狀況來判定菌種蛋白質降解能力［12］。

（6）不同溫度生長能力的測定：將3種菌種分別接種于液體 MRS培養基中，分別在5，15，25，35，45℃下恒溫培養24h，同時把液體 MRS培養基作為空白對照組，于600nm下測定菌液的吸光度值。

（7）抑菌能力的測定：將待測菌株接種到 MRS液體培養基中，于3 6℃恒溫培養48h，離心法取得發酵上清液，然后用牛津杯法測定各菌株發酵液的抑菌活性。牛津杯法的操作：將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌涂布于基礎培養基上，將經滅菌的牛津杯間隔放置在指示菌平板上。首先向各個牛津杯中分別滴加200μL的乳桿菌發酵上清液，然后將混合菌液以1∶1（V∶V）的比例滴加到各牛津杯中，于3 6℃恒溫培養24h后取出，測量各抑菌圈直徑的大小［13］。

1.3.3 鵝肉發酵香腸的工藝流程

1.3.4 單因素試驗設計

（1）菌種配比的影響：根據菌種發酵性能測定結果并考慮經濟、操作方便等因素，在此次試驗中從3種菌種中選出植物乳桿菌和戊糖片球菌作為復合發酵劑。有研究［14］表明，菌種配比對香腸的酸度影響較小，但是對香腸風味影響很大，所以在此次試驗中主要是選擇產生良好風味的發酵劑配比。本試驗選取發酵溫度3 6℃，發酵時間24h，對植物乳桿菌和戊糖片球菌的復合配比進行兩因素三水平的試驗，并對產品進行感官評價。

（2）發酵時間的影響：在混合菌種（Lp∶Pp）配比1∶1（V∶V），接種量3%（V/m），發酵溫度3 6℃的條件下，發酵時間分別選擇6，12，18，24，30h進行試驗，測量香腸的p H值。

（3）混合菌種接種量的影響：在混合菌種（Lp∶Pp）配比1∶1（V∶V），發酵溫度36℃，發酵時間24h的條件下，接種量（V/m）分別選擇1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%（菌體細胞的濃度是107CFU/mL）進行試驗，從發酵開始每隔6h對每一接種量的香腸的pH值進行測定。

（4）發酵溫度的影響：在混合菌種（L p∶Pp）配比1∶1（V∶V），接種量為3%（V/m）的條件下，分別于27，30，33，36，40℃發酵36h，從發酵開始每隔6h對每一溫度下的香腸的pH值進行測定［8］。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 pH值的測定 取發酵香腸內容物10g，搗碎后加入90mL蒸餾水，震蕩浸提20min后提取上清液，用精密pH計測定pH值。

1.4.2 菌落總數 按GB 4789.2—2010《食品衛生微生物檢驗菌落總數測定》中的平板計數法執行。

1.4.3 感官評分 由10名有感官評分經驗的教師組成評定小組，按照外觀、組織狀態、風味，逐一對發酵香腸進行評價打分，其標準見表1［9］。

表1 香腸感官評價標準Table 1 Fermented sausage sensual evaluation standard

2 結果與分析

2.1 菌種發酵性能的試驗結果

2.1.1 耐食鹽性測定結果 在發酵香腸的加工中，食鹽有防腐保鮮、調味及提高保水性等作用。有研究［6］表明，一定的食鹽濃度能抑制腐敗菌的生長，減少對蛋白質的分解。食鹽濃度對發酵香腸的發酵有顯著的影響，一般發酵劑要求其耐鹽性達到6%［15］。本研究以菌種在液體培養基中吸光值的變化，研究其耐食鹽性，結果見表2。

由表2可知，3種菌種均受食鹽含量變化的影響，食鹽濃度增加，菌種的生長受到抑制，吸光值變小。其中嗜酸乳桿菌的吸光值隨食鹽濃度的增加變化大，而植物乳桿菌和戊糖片球菌的變化相對較小。說明嗜酸乳桿菌的耐鹽能力低于植物乳桿菌和戊糖片球菌。

表2 不同食鹽濃度下各菌種的吸光度值Table 2 Absorbency value of various strains in different salt concentrations

2.1.2 耐亞硝酸鹽性測定結果 在發酵香腸的加工中，加入亞硝酸鹽可以增強產品風味和色澤，抑制細菌的增殖，對肉毒梭狀芽孢桿菌抑制作用明顯，保證制品的微生物安全性。發酵香腸生產所選的發酵劑一般要求可耐100mg/kg的亞硝酸濃度，否則會抑制發酵菌種的發酵性能，且成品中的亞硝酸鹽殘留量也會增加，影響發酵香腸的安全性［16］。本研究以吸光值的變化作為菌種的生長指標，研究菌種的耐亞硝酸鹽性，結果見表3。

表3 不同亞硝酸鈉濃度下各菌種的吸光度值Table 3 Absorbency value of various strains in different sodium nitrate concentrations

由表3可知，隨著亞硝酸鈉濃度的增加，植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌的生長均受到不同程度的抑制。其中嗜酸乳桿菌的吸光度值隨亞硝酸鹽濃度的增加而變化明顯，植物乳桿菌和戊糖片球菌的變化相對緩慢。由此可知，嗜酸乳桿菌的耐亞硝酸鹽性低于戊糖片球菌和植物乳桿菌。

2.1.3 產粘性試驗測定結果 在香腸發酵過程中，不能產生黏液，否則會破壞發酵香腸的內部組織結構。通過觀察培養基培養情況（見表4）可以發現，3種菌的產粘性相對都很低，但是嗜酸乳桿菌的菌體出現流體狀的情況比其他2種菌的嚴重一些，表明3種菌種均符合發酵香腸的發酵要求，其中植物乳桿菌和戊糖片球菌更加適合。

2.1.4 拮抗性試驗測定結果 本研究以單個菌種和兩兩混合的菌種（1∶1，V∶V）在培養基上劃線培養觀察其菌落總數來判斷其拮抗性，結果見表5。

表4 各菌種產粘性結果Table 4 The result of different strains for glischrogenou

由表5可知，3種菌種單獨培養24h后菌種數量均有所增長，兩兩混合菌種培養后的菌落數量相對單個菌種培養的菌落總數變化不大。由此可知，3種菌種之間兩兩的拮抗性不大，其中植物乳桿菌和戊糖片球菌的組合相對較好。因此，植物乳桿菌和戊糖片球菌可以作為發酵香腸的混合發酵劑。

2.1.5 蛋白質分解試驗測定結果 發酵香腸的生產中，要求蛋白質分解只在其內源蛋白酶的作用下降解產生多肽、氨基酸及風味物質，發酵劑應不具有降解蛋白質的作用。若發酵劑具有降解蛋白質的能力，則會在生產貯藏銷售中產生胺類等堿性物質，導致腐敗［17，18］。本研究用加入脫脂乳的培養基培養24h，觀察其降解蛋白質的能力，結果見表6。由表6可知，植物乳桿菌菌落周圍無透明光圈，嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌菌落周圍的光圈不明顯。因此，3種菌種均符合發酵香腸的生產要求。

表6 各菌種蛋白質分解能力試驗結果Table 6 The result of different strains for protein decomposing ability

2.1.6 菌株不同溫度下的生長能力測定結果 低溫發酵香腸發酵溫度一般為18～24℃，高溫發酵香腸發酵溫度一般為28～36℃［15］。這就要求菌種要選擇適當的生長溫度。由圖1可知，在不同的溫度條件下培養，菌種的生長速度有較大的差異，隨著溫度的增加，其生長速度逐漸增加，當溫度在35℃時，生長速度最快。由此可知，35℃左右是最適合3種菌種生長的溫度。

2.1.7 菌種抑菌能力的測定結果 發酵香腸以生肉為原料，且多為生食，在發酵過程中殘留有致病菌和腐敗菌在所難免。其主要的致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等。本研究分別測定了3種菌種及兩兩混合菌種（1∶1，V∶V）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力，結果見表7。

圖1 3種菌不同溫度下的生長能力Figure 1 Growth ability of three kinds strains in different temperature

表7 乳酸菌的抑菌活性Table 7 Antibacterial circle diameter in tactic acid bacteria activity /mm

由表7可知，嗜酸乳桿菌的抑菌能力明顯低于其他2種菌；植物乳桿菌和戊糖乳桿菌混合菌液的抑菌效果優于其他2種混合菌液及單一菌液。根據耐鹽、耐亞硝酸鹽和粘性試驗的結果，選擇植物乳桿菌和戊糖片球菌混合菌種作為鵝肉發酵香腸的發酵劑。

2.2 菌種最優配比試驗結果

在發酵初期植物乳桿菌大量繁殖產生乳酸，香腸的pH值下降較快，影響戊糖片球菌的繁殖；發酵后期戊糖片球菌能夠更好的生長，并分解蛋白質和脂肪，產生氨基酸和脂肪酸，賦予香腸良好的風味［4］。為了考察植物乳桿菌和戊糖片球菌的交互作用對發酵香腸感官評價的影響，并確定二者的最優配比，設計了兩因素三水平的試驗，結果見表8、9。

由表8可知，隨著植物乳桿菌添加量的增加，感官評分呈下降趨勢；而隨著戊糖片球菌添加量的增加，香腸的風味漸佳，有利于鵝肉發酵香腸質量的改善。因此確定混合發酵劑的最優配比是最終在植物乳桿菌和戊糖片球菌以1∶1（V∶V）的比例混合，接種量為3%。此配比下生產的發酵香腸的質地柔軟有彈性，切片性較好，而且顏色鮮紅，酸味柔和，口感達到最佳。

由表9可知，植物乳桿菌和戊糖片球菌對鵝肉發酵香腸的感官評價均有顯著影響，此外，二者之間的交互作用所產生的效應對鵝肉發酵香腸的感官評價也在0.01水平上影響顯著，所以應充分考慮二者相互作用產生的效應對產量的影響，尋找兩因素的最佳組合。

表8 菌種配比對香腸品質影響的試驗設計及結果Table 8 Different strains ratio on the sausage-quality experimental design and results（n＝3）

表9 方差分析表Table 9 ANOVA table

表9 方差分析表Table 9 ANOVA table

誤差項及交互項參考文獻［19］的方法確定。

差異源 平方和 自由度 均方差 F值 F臨界值顯著水平植物乳桿菌 78 2 39 8.775 F0.01＝6.01 顯著戊糖片球菌 666 2 333 74.925 F0.01＝6.01顯著交互 1 614 4 403.5 90.7 875 F0.01＝4.58顯著誤差80 18 4.444 444總計2 438 26

2.3 菌種在發酵過程中相關因素的確定

2.3.1 發酵時間的確定 由圖2可知，鵝肉發酵香腸接種后，其pH值開始下降，在0～12h，pH值的下降速度較慢，在12～24hpH下降的速度較快，發酵24h后，其pH值趨于穩定。此時香腸pH值為4.87，符合發酵香腸的pH標準，再延長發酵時間會增加生產成本。因此，發酵時間選擇為24h。

圖2 發酵時間對發酵香腸pH值的影響Figure 2 Effect of fermentation time on pH value of goose sausage

2.3.2 發酵溫度的確定 發酵溫度的選擇關系到混合發酵菌種及腸內各類微生物的生長競爭和平衡。由于發酵香腸的原材料未經殺菌處理，為了保證發酵安全，應該迅速使發酵劑成長為優勢菌種，以產生乳酸，降低pH值，抑制雜菌生成。

圖3顯示了發酵香腸在不同溫度下的產酸速度。在較高的溫度（39℃）時，產品發酵速度快，但腸體滲油現象比較明顯。而在較低的溫度（27，30，33℃）時，產酸速度較慢，發酵周期長，易引起其他雜菌的生長。而在36℃發酵時，發酵得到的產品酸度適中，故選擇36℃作為發酵溫度。

圖3 發酵溫度對發酵香腸pH值的影響Figure 3 Effect of fermentation temperature on pH value of goose sausage

2.3.3 菌種接種量的確定 由圖4可知，發酵菌種的接種量與產酸速度正相關，即發酵菌種接種量越大，產酸速度越快，這與李俊芳等［20］的研究結果一致。但是接種量過大（4%，5%，V/m）時，pH值會快速下降到較低值，使得短時間內由于腸內積累了大量的酸，且分布不夠均勻，使得腸的酸味刺激性較大，香味也不夠充足。而接種量過小（1%，2%，V/m）時，不僅產品的發酵周期較長，而且在發酵初期易受其他雜菌的污染。所以，接種量在3%（V/m）出現最佳值。

3 結論

圖4 接種量對發酵香腸pH值的影響Figure 4 Effect of inoculum quantity on pH value of goose sausage

從耐食鹽、耐亞硝酸鹽性、是否產粘性、菌種之間是否有拮抗性，蛋白質的分解能力和菌種的抑菌能力方面對菌種發酵性能方面進行研究，從而確定植物乳桿菌和戊糖片球菌組成的混合發酵劑是鵝肉發酵香腸的最優發酵劑，二者按1∶1（V∶V）配比、接種量為3%（V/m）、在36℃恒溫發酵2 4h的條件下制成的鵝肉發酵香腸的pH值和水分活度均達到所需的要求，且呈現出質地柔軟富有彈性、切片性好、顏色紅潤、酸味柔和、口味上乘的品質。此外，隨著接種乳酸菌的發酵，香腸pH值迅速下降，使得有害雜菌的生產和繁殖受到顯著抑制，從而提升了鵝肉發酵香腸的安全性和穩定性。

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