不同溫度生理鹽水對采集乳腺腫瘤標本的影響

童琛曄 馮原 蔣冰瑩 查黎萍 唐艷紅

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院手術室，上海200025）

為了建立符合我國經濟發展水平的生物樣本庫，促進生物樣本庫建設過程中的有益知識和技術方法的傳播，我院手術室聯合乳腺疾病診治中心于2012年起開始研究并構建上海及周邊地區早期乳腺癌生物樣本庫，用以完善乳腺癌相關臨床及基礎研究的進行。我們參照2011年“中國醫藥生物技術協會生物樣本庫標準（試行）”（以下簡稱“標準”），并結合自身的特點，制定了一套符合我們醫院的乳腺腫瘤生物樣本采集、保存的標準化流程（SOP）。我們探討不同溫度的無菌生理鹽水對采集乳腺腫瘤組織標本的影響，建立更加規范的生物樣本采集、保存的SOP。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年10～12月乳腺癌腫瘤直徑≥2.5cm的組織標本60例，由經過培訓的專人負責采集標本。

1.2 材料準備 上海長征富民金山制藥公司生產的長富牌無菌生理鹽水，500ml裝，玻璃瓶；潔定（GETINGE）公司加溫暖箱；三菱公司家用冰箱；海爾公司超低溫保存箱；滅菌溫度計；經過處理的無RNA酶的刀片、眼科剪和尺、鑷子等；手套，口罩等標準保護器材；其他材料：記號筆，標簽，凍存管，采集標本的操作臺等。

1.3 采樣方法 每次取樣前分別取無菌生理鹽水3瓶放于潔凈手術室室溫（22～26℃）、三菱公司冰箱冷藏室（4℃）、潔定公司加溫暖箱中（40℃），取材前準備好標有病例姓名縮寫、住院號、腫瘤組織部位（T）、無菌生理鹽水漂洗液的溫度（C1、C2、C3）標簽的凍存管。待標本離體后，采集專員取出3瓶無菌生理鹽水并打開，用滅菌溫度計分別測試3瓶生理鹽水的溫度，4～8℃的無菌生理鹽水標記為C1，22～26℃的無菌生理鹽水標記為C2，37～41℃的無菌生理鹽水標記為C3。在標本離體后的30min內，更換器具切取腫瘤組織標本的1／5，0.5cm×0.5cm×0.5cm，并平均分成3份，分別用C1、C2、C3的生理鹽水漂洗兩次以洗去血液與污漬，再分別裝入已編號的凍存管中，旋緊蓋子后放入-80°超低溫冰箱保存。于24h內由專職人員將凍存管轉移至實驗室由專職實驗人員進行標本的總RNA提取鑒定。

1.4 鑒定標準 用紫外分光光度計對RNA樣品進行量測，若吸光度ODZ60／OD280＞1.6，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳后，可見明顯的28s和18s條帶，若28s亮度比18s要高1～2倍，則表明RNA標本保存完好[2]。

1.5 統計學方法 采用SPSS 11.5建立數據庫，采用統計描述、χ2分析等方法進行統計學分析。P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結果（表1）

表1 不同溫度生理鹽水與腫瘤標本質量情況比較 （例）

表1提示，三組標本RNA保存質量有顯著性差異（P＜0.01），使用C1漂洗過的標本RNA保存質量最高。

3 討論

3.1 生理鹽水在采集乳腺腫瘤組織標本中的作用

臨床生物樣本是基礎研究與臨床研究的寶貴資源，規范地采集、保存生物樣本可以避免樣本的損壞與流失，節約資源。根據“標準”中所提及的在采集標本前需對標本進行生理鹽水漂洗以去除其表面的血液及污物也是保證生物樣本質量的一個重要手段。手術中的離體標本不可避免有血液污染，血液也有其DNA／RNA，若不進行漂洗而直接采集標本，則可能導致將來抽取腫瘤標本的DNA／RNA時，會受到血液DNA／RNA的影響，而影響最終的研究結果。如果采用其他溶液漂洗腫瘤標本，如滅菌注射用水，則可能會導致腫瘤細胞腫脹破裂死亡，而最終無法抽取腫瘤細胞的DNA／RNA，無法開展進一步的研究。因此，對于腫瘤標本漂洗溶液的選擇當然是應該選擇等滲、不影響腫瘤細胞活性、又不會添加其他成分的0.9%無菌生理鹽水。

3.2 不同溫度的生理鹽水對采集乳腺腫瘤組織標本的影響 通過此次研究發現，用不同溫度生理鹽水漂洗腫瘤標本，對標本的采集、保存是有影響的。鑒定標本的保存質量主要看標本的總RNA，并用紫外分光光度計對RNA樣品進行檢測[2]。有研究發現樣本取材時間對樣本RNA質量存在著關鍵影響，眾多文獻推薦在樣本切除后30min內取材[2-3]。因此，在此次實驗中，我們嚴格控制取材時間＜30min，并由專人負責采集、送檢、檢驗標本，力求控制影響實驗結果的所有變量，僅僅觀察用不同溫度生理鹽水漂洗后，標本總RNA的質量。由表1可看出，用不同溫度生理鹽水漂洗腫瘤標本后，RNA保存質量存在顯著性差異（P＜0.01），用冷的甚至是冰的生理鹽水漂洗腫瘤標本更能完好的保存腫瘤細胞的RNA。這是因為溫度越低，越有利于降低細胞活性，避免腫瘤細胞基因組DNA、RNA和蛋白的降解。

3.3 建立乳腺腫瘤組織標本采集、保存的標準化流程 參照“標準”，并結合此次的實驗結果、自身的特點，我們制定了一套符合我們醫院的乳腺腫瘤生物樣本采集、保存的標準化流程。我們強調采集專員在取材前準備好標有病例姓名縮寫、住院號、組織部位（T／P／N）的標簽的凍存管和包埋盒，組織塊取下后，先用4～8℃的無菌生理鹽水漂洗標本以去除血液與污漬。

綜上所述，在采集乳腺癌腫瘤組織標本的過程中，使用4～8℃的無菌生理鹽水漂洗標本后對腫瘤標本的RNA保存質量影響最小，可增添至生物樣本采集、保存的標準化流程中。

[1]《中國醫藥生物技術協會生物樣本庫標準（試行）》[J].中國醫藥生物技術，2011，6（1）：71-79.

[2]季加孚.北京大學臨床腫瘤學院標本庫的建設[J].北京大學學報（醫學版），2005，37（3）：229-330.

[3]Mager SR，Oomen MH，Morente MM，et al."Standard operating produre for the collection of flesh frozen tissue samples[J].Eur J Cancer，2007，43（5）：828-834.