無選擇標記的轉基因家畜制備技術

魏慶信+畢延震+鄭新民

摘要：選擇標記基因（Selectablemarkergenes，SMGs）為目前應用體細胞核移植技術制備轉基因家畜所必須。然而一旦完成篩選得到所需要的轉化細胞或完成轉基因動物的構建之后，SMGs就變成不需要的或多余的，而且這些帶有標記基因的家畜還存在安全方面的隱患。因此，建立無選擇標記的轉基因家畜技術勢在必行。目前能夠采取的策略一是在篩選轉化細胞或構建成功目的基因表達的家畜之后，刪除SMGs;二是使用無篩選標記的轉基因技術。綜述了應用Cre/LoxP位點特異性重組系統刪除SMGs的各種方法，以及應用鋅指核酸酶（ZFNs）、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因編輯技術，基于受精卵顯微注射的無篩選標記轉基因技術的研究進展，分析對于制備無SMGs的轉基因家畜而言后者的優勢所在，旨在為轉基因家畜研究提供參考。

關鍵詞：轉基因家畜;選擇標記;基因刪除

中圖分類號：S185;Q789文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）21-5057-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.001

PreparingTransgenicLivestocksWithoutSelectableMarker

WEIQing-xin，BIYan-zhen，ZHENGXin-min

（HubeiAcademyofAgricultureScience/HubeiKeyLabofAnimalEmbryoandMolecularBreeding，Wuhan430064，China）

Abstract：Selectablemarkergenes（SMGs）arenecessaryforproducingtransgeniclivestockbytransferringnuclearofsomaticcellcurrently.SMGswillbecomeunnecessary，redundantorevenhiddendangerafterobtainingtransgeniccellsoranimal.Theestablishmentofmarker-freetransgeniclivestocksisimperative.Therearetwostrategiescurrently.Oneistoremovemarkerafterscreeningtransformedcellsorbuildinggenelivestocksexpressionsuccessfully.Anotherisusingnon-selectivemarkertransgenictechnology.MethodsaboutusingCre/LoxPsite-specificrecombinationsystemtoremoveSMGs，applyingnewgeneeditingtechnologiesincludingzincfingernuclease（ZFNs），TALENandCRISPR/Cas9，microinjectionwithmarkerfreetransgenictechnology，andtheadvantagesofbuildingtransgeniclivestockswithoutSMGswerereviewed.Itwillprovidereferenceforfutherstudyingthetransgeniclivestocks.

Keywords：transgeniclivestock;selectablemarker;generemove

先期的家畜轉基因技術（如顯微注射、精子介導和病毒感染等方法）是依靠分子生物學技術在個體水平或胚胎水平上進行篩選，因而不需要在轉化載體中設置選擇標記。但這些方法不僅效率低，而且外源基因是隨機整合的，病毒感染法還存在載體安全隱患。體細胞核移植技術的出現，使家畜的轉基因從隨機整合發展到靶向修飾，規避了隨機整合所帶來的非預期效應和不確定性，能有效地實行外源基因的定位整合、基因敲除和其他定向的遺傳修飾，成為目前制備轉基因家畜的主流方法之一。然而這種方法需要對轉化的細胞進行篩選，這就必須引進選擇標記基因。

選擇標記基因（Selectable marker genes， SMGs）可分為兩類：一類是指其編碼產物能夠使轉化的細胞具有對抗生素的抗性，在培養基中加入抗生素等選擇試劑，非轉化的細胞死亡或生長受到抑制，而轉化的細胞能夠繼續存活，從而將轉化的細胞從大量的細胞中篩選出來的一類基因。構建轉基因動物常用的這類標記基因有 kan（卡那霉素）、amp（氨芐青霉素）、neo（氨基糖苷磷酸轉移酶基因）、tk（胸腺嘧啶激酶基因）等。另一類也稱報告基因（Reporter gene），是指其編碼產物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經成功地導入受體細胞、組織或器官，并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。目前轉基因動物常用的報告基因是GFP（綠色熒光蛋白基因），由GFP衍生出來的還有BFP（藍色熒光蛋白基因）、YFP（黃色熒光蛋白基因）等各種可視光的熒光蛋白基因。一旦完成篩選得到所需要的轉化細胞或完成轉基因動物的構建之后，SMGs就變成不需要的和多余的[1]，而且這些帶有標記基因的動物還存在安全方面的隱患：①當人們食用了轉基因動物的產品，SMGs編碼蛋白有可能被轉移到人體的細胞或腸道微生物中，從而可能會降低抗生素在臨床治療中的有效性;②SMGs編碼蛋白是否會成為新的致敏原，尚不得而知;③報告基因的存在會讓消費者產生一種心理排斥反應;④有研究表明，綠色熒光蛋白轉基因小鼠與對照組比較，體重和攝食量明顯降低，部分臟器（肝臟、胸腺）發育不良，不排除外源GFP基因對動物發育存在一定毒性[2]。

因此，為了消除SMGs的安全隱患，建立無選擇標記的轉基因家畜制備技術勢在必行。目前能夠采取的策略：一是在篩選轉化細胞或構建成功目的基因表達的動物之后，刪除選擇標記基因;二是使用無篩選標記的轉基因技術。

1 ?SMGs的刪除技術

目前用于轉基因生物刪除選擇標記基因的方法主要有：共轉化法、轉座子法、位點特異性重組法和染色體內同源重組法。而應用于轉基因家畜刪除SMGs的，主要是位點特異性重組技術體系。

位點特異性重組技術是通過對特定序列進行準確切割和重新連接，從而對生物進行遺傳改造的一種技術，是利用重組酶催化特異的重組位點間發生重組，導致重組位點間相互交換的一種精確重組形式。來源于微生物的位點特異性重組酶系統是一類很好的刪除SMGs的工具。位點特異性重組系統包含兩個部分：重組酶（Recombinase）和該重組酶能特異識別的位點（Recognition site）。重組酶是源于細菌或酵母可識別特異位點發生精確重組的一類酶。根據序列的同源性及催化氨基酸的特性，重組酶可分為酪氨酸和絲氨酸兩個家族。目前已使用的重組系統包括：FLP/FRT、Cre/LoxP、R/RS及不可逆重組系統等，能夠在動、植物中發生重組反應的主要是前3類，其中Cre/LoxP在轉基因動物中研究得較為深入和廣泛。

Cre/LoxP位點特異性重組系統是Sternberg等[3]首先在大腸桿菌噬菌體p1中發現的，由Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。Cre重組酶是噬菌體pl編碼的分子質量為38.5 kD的蛋白質，有1 029個核苷酸序列編碼，能識別并催化LoxP位點的分子內和分子間的特異性重組。根據LoxP位點的排列形式，會產生3種重組結果：如果2個LoxP位點位于一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶能有效切除2個LoxP位點間的序列[4];如果2個LoxP位點位于一條DNA鏈上但方向相反，Cre重組酶能導致2個LoxP位點間的序列倒位[5];如果2個LoxP位點分別位于2條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導2條DNA鏈的交換或染色體易位[6]。

利用Cre/LoxP系統刪除SMGs有3種方式：質粒轉染，蛋白轉導以及在分別構建轉Cre和轉LoxP動物的基礎上，通過雜交的方法刪除SMGs。

1.1 ?Cre酶的質粒轉染

質粒轉染是指用Cre酶的重組表達質粒轉染動物細胞，利用Cre酶的表達，切除LoxP位點錨定的SMGs。質粒轉染的時機，可在核移植前進行，對動物細胞實行二次轉化，切除細胞中的SMGs，然后再核移植，獲得無SMGs的轉基因動物;也可在獲得轉基因動物之后，對轉基因動物的細胞進行轉染，切除細胞中的SMGs，然后應用無SMGs的細胞進行核移植，從而獲得無SMGs的轉基因動物。

王志蕊等[7]將含有LoxP位點錨定的選擇標記表達框（LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-Lox） 的ΔMSTN打靶載體，用電穿孔技術導入豬腎PK15細胞，經G418篩選，獲得穩定整合該載體、EGFP表達均一的單克隆細胞系;然后將重組酶表達質粒pTurbo-Cre導入該細胞系，借助流式分選（FACS）、終點PCR、熒光定量PCR、TA克隆與測序等手段，證明Cre/LoxP重組系統可在豬細胞內高效介導內源性選擇標記基因的刪除反應，EGFP水平的刪除效率達到46.1%，DNA水平的刪除效率達到97.0%。然而豬腎PK15細胞畢竟是一種模型細胞，不能用于核移植生產克隆動物。上述技術體系尚需用分離的體細胞，如成纖維細胞等，觀察二次轉化之后細胞的生長態勢。蘭翀等[8]利用pBS185瞬間表達法刪除首次轉基因克隆內的標記基因，但因細胞老化嚴重，最終未獲得可供檢測用的單克隆細胞。表明用對體細胞進行二次轉化的方法刪除SMGs，存在細胞老化的風險。

在成功構建轉基因動物之后，利用Cre酶的質粒轉染轉基因動物的體細胞，可以規避細胞老化的風險，有效地刪除SMGs。Kuroiwa等[9]將Cre瞬時表達質粒轉染轉基因牛的成纖維細胞，篩選出無SMGs的細胞用于核移植，最終獲得了無SMGs的免疫球蛋白μ鏈和PRNP雙基因敲除的牛。Wang等[10]應用PBS185質粒轉染轉基因牛成纖維細胞，通過Cre酶的瞬時表達，有80%的細胞內SMGs被刪除。然而應用這種方法最終獲得無SMGs的轉基因家畜，試驗周期長，成本高。

為了縮短試驗周期并防止二次轉化所引起的細胞老化，可采取細胞拯救技術[11]。所謂細胞拯救，即是在第一次轉化之后，用第一次轉化的細胞作核供體進行核移植，獲得重構胚;重構胚移植到代孕母畜后，取懷孕母畜的胎兒成纖維細胞（對豬而言，取懷孕35日齡的胎兒成纖維細胞）用Cre酶的質粒進行第二次轉染，刪除SMGs，再以刪除SMGs的轉基因細胞進行核移植，從而獲得無SMGs的轉基因家畜。

1.2 ?Cre酶的蛋白轉導

蛋白轉導可以高效地將有活性的蛋白直接轉入動物細胞中，其原理是通過重組的方法改變目的蛋白的生物特性，尤其是加入與細胞滲透性有關的蛋白結構域，即所謂的蛋白轉導結構域（Protein transduction domains， PTDs），如TAT（反式激活蛋白，來源于人類免疫缺陷病毒HIV，由11個氨基酸組成）、FGF（疏水多肽）、NLS（核定位序列）等。Cre/LoxP重組系統通過蛋白轉導刪除SMGs，在動物中常用的是TAT-Cre。

許媛媛[12]將純化的TAT-Cre與轉入溶菌酶基因山羊的耳成纖維細胞共孵育，通過培養、挑克隆、G418敏感性試驗、PCR及Southern鑒定，最終獲得抗性基因刪除，保留了人溶菌酶基因表達框的單細胞克隆，抗性基因的刪除效率為42%。蘭翀等[8]利用TAT-Cre處理已經過一次轉化的山羊成纖維細胞系，盡管刪除SMGs的效率可達到43.9%，但這一過程經歷了連續兩次低密度傳代和單細胞克隆的挑取，所獲得的單細胞克隆嚴重老化，無法進一步傳代，最終未獲得可供克隆用的單克隆細胞;而他們用TAT-Cre酶處理人溶菌酶轉基因山羊的耳成纖維細胞，成功刪除了SMGs，其刪除效率達72.8%。Yu等[13]在完成第一次修飾的基礎上，通過轉導TAT-Cre蛋白，獲得了無抗性標記的轉基因成纖維細胞，繼而通過核移植得到了轉基因克隆牛;令人欣喜的是他們通過一次遺傳轉化和一次蛋白轉導，并沒有造成細胞的老化，只是仍然殘留報告基因EGFP，修飾并不徹底。

1.3 ?通過雜交的方法刪除SMGs

通過雜交的方法獲得無SMGs的轉基因家畜，需要經過3個步驟：Cre轉基因家畜的構建;LoxP轉基因家畜的構建;兩種家畜交配產生無SMGs的轉基因家畜。子代家畜可以在體內表達Cre重組酶，從而將基因組內的兩個LoxP位點間的序列切除。Carlson等[14]通過LoxP-SM-APOBEC3G轉基因豬與PGK-YFP-Cre轉基因豬交配，獲得了無SMGs的子代豬。

用這種雜交的方法刪除SMGs，試驗周期更長，成本更高，因而少有人采用。

2 ?無篩選標記的轉基因技術

使用無篩選標記的轉基因技術對于防范SMGs的安全風險，顯然是最好的選擇。然而這種技術要求具備以下2項基本條件：①轉化效率高。由于有高的轉化效率，就可以通過受精卵的顯微注射，在胚胎水平或個體水平上篩選遺傳轉化的胚胎或動物。②能精確地實行靶向修飾（或定位整合）。近幾年出現的基因編輯技術，如鋅指核酸酶（ZFNs）技術、TALEN技術和CRISPR/Cas9技術，不僅能實現精確的靶向修飾，而且轉化效率高，滿足了上述2項基本要求，為制備無篩選標記的轉基因家畜提供了可行的技術路線。

ZFNs是高效的動物基因組位點特異性修飾酶，能夠誘導生物體內的DNA在特定位置產生雙鏈斷裂，形成“雙鏈斷裂缺口”（Double strand break，DSB）。DSB可啟動細胞內的DNA損傷修復機制，從而實現靶向基因敲除或敲入。Geurts等[15]最先應用ZFNs的DNA和mRNA進行胚胎顯微注射，獲得遺傳修飾動物，他們將編碼ZFNs的DNA質粒和mRNA分別顯微注射到大鼠原核期的原核或胞質中，得到免疫球蛋白M基因（Immunoglobulin M，IgM）和Rab38基因敲除的大鼠。分析Geurts等人的試驗結果，質粒原核注射共移植胚胎1 384枚，獲得基因敲除動物18只，其效率為1.3%;mRNA原核注射共移植胚胎389枚，獲得基因敲除動物59只，其效率為15.2%;mRNA胞質內注射共移植胚胎414枚，獲得基因敲除動物38只，其效率為9.2%。Meyer等[16]針對小鼠Rosa26基因設計了1對ZFN，并且將構建的潮霉素基因同源打靶載體、β-半乳糖苷酶及Venus同源打靶載體，分別和ZFN的mRNA共同注射小鼠原核胚胎，產生轉基因小鼠，同源打靶效率為1.7%～4.5%。Lillico等[17]將 ZFN的mRNA顯微注射豬的受精卵，在得到的9頭仔豬中，有一頭實現了基因編輯。

TALEN效應蛋白（Transcription activation-like effector nucleases，轉錄樣激活因子蛋白）是一種比ZFNs更容易設計、特異性更高的人工核酸內切酶。其原理類似于ZFNs，即可在識別特定DNA序列的基礎上引入切割，造成雙鏈斷裂（Double-strand break， DSB），從而實現基因敲除和敲入[18，19]。利用TALEN技術，通過受精卵顯微注射的途徑對動物進行基因編輯，國內外已有多篇報道。例如：Anegon實驗室利用TALEN技術，采用胚胎注射的方法使大鼠的IgM基因產生突變[20]。周芳芳等[21]將TALEN mRNA顯微注射到受精卵內，在得到的45只仔鼠中，有6只在MSTN基因靶標位置發生了突變，基因編輯的效率為13.3%。Carlson等[22]將TALEN mRNA顯微注射到牛和豬胚胎的胞質內，有75%的胚胎實現了基因編輯。Lillico等[17]將TALEN mRNA顯微注射到豬的受精卵，在得到的39頭仔豬中，有8頭實現了基因編輯。

CRISPR/Cas9是一種全新的人工核酸內切酶，Cong等[23]首次報道，利用CRISPR/Cas9系統對人293T 細胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A細胞的Th基因實現了定點突變。之后的短短一年多時間，該系統被成功地應用于各種動物的基因編輯。相對于ZFNs和TALEN，CRISPR/Cas9系統具有突變效率更高、更精確、制作簡單及成本低的特點。世界上第一個研究轉基因動物的Wang等[24]將Cas9、Tet1和Tet2特異性的sgRNA注射到小鼠受精卵中，以高達80%的效率成功地在4個位點敲除了這2個基因，得到了雙基因敲除的純合子小鼠。這種基于受精卵注射的CRISPR/Cas9技術被稱為“一步法”。Li等[25]在將CRISPR/Cas系統導入小鼠受精卵刪除大片段DNA時，其試驗的結果RNA注射比DNA注射更有效。欣喜的是，這種基于受精卵注射的CRISPR/Cas9技術（一步法）很快被成功地應用于家畜的基因修飾中。Hai等[26]應用CRISPR/CAS系統的一步法，獲得了vWF基因敲除豬。

由于ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas9技術的高效性和精確的靶向性，可以直接采用受精卵的顯微注射技術制備轉基因家畜，從而避開標記基因的使用。

對于制備無SMGs的轉基因家畜而言，使用無標記基因的轉基因技術，相對于先引入SMGs，而后再將其刪除的復雜技術體系，具有顯而易見的優勢：①基因操作簡便，只需構建一次基因打靶載體，且無需引入標記基因。②胚胎操作簡便，只需應用受精卵的顯微注射技術，即可一步到位，從而規避了克隆技術的操作復雜、效率低下和重編程不完全所引發的一系列問題。由此，近些年有些被冷落的受精卵顯微注射技術，將作為一種制備轉基因家畜的主流技術重新受到青睞。

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