Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因克隆與序列分析

任邵娜+袁生+蒲文珺+彭巧麗+王輝+陳志偉+張浩吉+李國清

摘要：為了了解鴨肝炎病毒的遺傳變異情況，試驗采用RT-PCR方法對采自廣東省各地12個DHV臨床分離株的VP1基因進行了擴增、克隆、測序和序列分析。結果表明，12個DHV分離株的VP1基因序列長度均為714 bp，編碼238個氨基酸，12個分離株與GenBank公布的參考株核苷酸同源性為91.7%～95.8%，氨基酸同源性為94.5%～98.3%，而12個分離株之間的核苷酸序列同源性達到99.2%～100%，氨基酸同源性為97.9%～100%。系統(tǒng)分析證明，12個DHV分離株均為DHV-Ⅰ型，不同分離株VP1基因無堿基插入和缺失，但存在點突變，各DHV分離株間親緣關系較近，但存在一定的遺傳差異。

關鍵詞：Ⅰ型鴨肝炎病毒;VP1基因;克隆;序列分析

中圖分類號：S852.65 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）15-5208-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.041

Cloning and Sequence Analysis of VP1 Gene of Duck Hepatitis A

REN Shao-na1，2，3， YUAN Sheng2， PU Wen-jun2， PENG Qiao-li3， WANG Hui3， CHEN Zhi-wei3，4， ZHANG Hao-ji1，2， LI Guo-qing1

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2.Department of Veterinary Medicine， Foshan University， Foshan 528231， Guangdong， China;

3.Shenzhen Laboratory， AIDS Institute， University of Hong Kong LKS Faculty of Medicine/Shenzhen Third Peoples Hospital， Shenzhen 518112， Guangdong， China; 4. AIDS Institute， University of Hong Kong LKS Faculty of Medicine， Hong Kong， China）

Abstract： In order to investigate the variation of Duck hepatitis virus（DHV）， a total of 12 DHV VP1 genes from different regions of Guangdong province in China were amplified， cloned and sequenced. The results showed that the lengths of all VP1 sequences were 714 bp， encoding 238 amino acids. Homology analysis revealed that the VP1 genes of 12 isolates shared 91.7%-95.8% nucleotide identity and 94.5%-98.3% amino acids identity with the reference strain of DHV from GenBank. Nucleotide sequence homology of VP1 gene among the 12 DHV isolates varied from 99.2% to 100%， while amino acid sequence homology varied from 97.9% to 100%. The phylogenetic analysis revealed that all the 12 isolates were DHV-Ⅰ， with no InDel， but having point mutations. All 12 isolates had a close genetic relationship with a few genetic differences.

Key words： DHV-Ⅰ;VP1 gene; cloning; sequence analysis

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是一種由鴨病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的以肝臟出血性腫大為特征的急性、烈性、高度致死性傳染病，主要感染3周齡以下的雛鴨，對1周齡內(nèi)雛鴨具有極強致死性[1]。病鴨臨床表現(xiàn)為角弓反張，剖檢可見肝臟腫大，有充血或出血斑。20世紀以來，該病成為危害雛鴨最為嚴重的疫病之一，給中國養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2]。

鴨肝炎病毒分為I型、II型和III型3個血清型，其中I型和III型屬于小RNA病毒科，II型屬于星狀病毒科，三者不能引起抗原交叉反應，但引起的癥狀與病變基本相同[3]。星狀病毒科引起的Ⅱ型鴨肝炎，目前為止僅英國有報道，與Ⅰ型鴨肝炎病毒相比，Ⅲ型鴨肝炎病毒的致病力較弱，對雛鴨的致病率很少超過30%。通常所說的鴨肝炎主要是指Ⅰ型鴨肝炎[4]。Ⅰ型鴨肝炎病毒包括3種血清型，即DHV-1（世界性分布傳統(tǒng)株血清型）、DHV-1B（臺灣地區(qū)分離株血清型）、DHV-1C（韓國分離株血清型），這3種血清型間沒有交叉中和，其中最常見、致病力最強且呈世界性分布的是DHV-1血清型[5]。

DHV的VP1蛋白包含病毒的主要抗原位點，可誘導中和抗體，也可作為感染的可靠指標。Oberste等[6]對小RNA病毒科的人腸病毒（Human enteroviruses）VP1基因部分序列的同源性進行了分析比較，建立了一種血清型分型標準：即核苷酸序列同源性≥75%和/或推導的氨基酸序列同源性≥88%的毒株可判定為同一血清型。DHV-Ⅰ同屬于小RNA病毒科，參照上述血清型分型標準，根據(jù)各毒株VP1基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析結果，可以判定鴨肝炎病毒的血清型[7]。本試驗以從廣東不同地區(qū)鴨群分離的12個鴨肝炎病毒株為研究對象，PCR擴增其VP1基因并進行序列分析，旨在闡明鴨肝炎病毒的遺傳變異情況，從而為研制鴨肝炎病毒亞單位疫苗奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?病毒株

病料采自廣東省不同地區(qū)的鴨群，由佛山科學技術學院動物醫(yī)學系實驗室分離得到12株鴨肝炎病毒，其中清遠2株、汕頭1株、恩平2株、臺山2株、三水1株、東莞1株、增城1株、高要1株、肇慶1株，分別命名為QY1、QY2、ST、EP1、EP2、TS1、TS2、SS、DG、ZC、GY、ZQ。

1.2 ?主要試劑

RNA提取試劑盒（High Pure Viral RNA Kit）為Roche公司產(chǎn)品;PrimeScript one step RT-PCR Kit、pMD-19T Vector、10×TAKARA Taq Buffer和DL2000 DNA Marker購自TAKARA公司;膠回收試劑盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）購自QIAGEN公司;感受態(tài)細胞Golden由香港大學李嘉誠醫(yī)學院艾滋病研究所深圳研究室制備。

1.3 ?引物設計

參照GenBank中VP1基因序列設計一對引物，上游引物為DHV-VP1-F：5′-GGT GAT TCC AAC CAG TTAG-3′，下游引物為DHV-VP1-R：5′-TTC AAT TTC CAA ATT GAG-3′，由Life Technologies公司合成。

1.4 ?RT-PCR擴增

取病毒尿囊液200 μL，按照說明書推薦的操作步驟提取病毒RNA。用一步法試劑盒進行RT-PCR 擴增。在50 μL PCR反應體系中加入PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、Primers各2 μL（濃度為10 μmol/L）、模板RNA 5 μL、用ddH2O補齊至50 μL。PCR反應條件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在紫外成像儀里觀察記錄結果。

1.5 ?目的基因的克隆和測序

將PCR產(chǎn)物按膠回收試劑盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）推薦的步驟進行回收，回收后PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞。通過菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒，篩選陽性重組質(zhì)粒送華大基因測序。

1.6 ?VP1基因序列分析

利用DNA Star中的MegAlign對研究獲得的12株DHV病毒的基因序列與GenBank中公布的DHV-Ⅰ全基因組參考序列（161/79/V株EU753359、03D株NC008250、 H株DQ249300、 5886株DQ249301、R85952株DQ226541、DRL-62株DQ219396、C80株DQ864514、A66株DQ886445、JX株EF093502、HP1株EF151312、E53株EF151313、S株EF417871、F株EU264072、R株EF585200、ZJ株EU841005、X株FJ496343、AV2111株EU395440、CL株EF427899）進行比對，并與部分代表性參考序列比較其核苷酸和氨基酸同源性。同時用Mega 4.0軟件對獲得的序列以及DHV-Ⅰ參考序列、韓國新型毒株參考序列（AP-04114株DQ812093、AP-04203株DQ256134、AP-04009株DQ256133、AP-03337株DQ256132）、臺灣地區(qū)新型毒株參考序列（90D株EF067924、04G株EF067923）進行比對及計算遺傳距離，然后用Mega 4.0程序中的鄰接法（Neighbor-joining method， NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 ?結果與分析

2.1 ?PCR擴增結果

采用一步法RT-PCR擴增，檢測結果（圖1）顯示，12株病毒分離株均擴增出714 bp的條帶，與目的基因大小基本相符。

2.2 ?VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分析

測序結果顯示，12株病毒的目的基因大小均為714 bp，編碼238個氨基酸。利用MegAlign軟件對擴增出的12株病毒的VP1基因和GenBank上下載的Ⅰ型鴨肝炎病毒全基因組序列進行比對（圖2），比較不同地區(qū)分離株間的序列同源性，并對推導的氨基酸序列進行比對（圖3）。結果發(fā)現(xiàn)，12株分離株與參考株DHV的核苷酸同源性為91.7%～95.8%，氨基酸同源性為94.5%～98.3%;12株分離株之間的核苷酸同源性為99.2%～100%，氨基酸同源性為97.9%～100%。參照同屬于小RNA病毒的人腸病毒（Human enteroviruses）血清型分型標準，12株分離株均為DHV-Ⅰ型，且各個分離株間同源性很高，說明各地區(qū)間DHV變異不大。其中，分離自肇慶和高要的2株病毒以及分離自三水和增城的2株病毒的VP1基因序列同源性最高，為100%，說明肇慶與高要之間、三水與增城之間的DHV毒株親緣關系最近。

2.3 ?VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對分析

與參考毒株相比，12株分離株均存在散在點突變現(xiàn)象，氨基酸也存在少數(shù)點突變，但沒有插入和缺失現(xiàn)象。分離株與參考株的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在第49位12株分離株全部為S，與弱毒株A66相同，而強毒株161/79/V為T，推測12株分離株為弱毒株。此外，12株分離株之間也有散在堿基和氨基酸的點突變，在139、214、354、382、471、523、560、577、676 bp位置共有9處堿基位點出現(xiàn)點突變;而氨基酸突變位點有7個，位置在第47、72、128、175、187、193、226位，這些核苷酸和氨基酸位點為研究DHV基因結構中決定毒力的基因位點奠定了基礎。12株分離株與DHV-Ⅰ參考株之間的核苷酸變異區(qū)域部分圖解見圖4。

2.4 ?系統(tǒng)進化分析

用Mega軟件對12個分離株和參考株進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建（圖5），結果發(fā)現(xiàn)，12株分離株與DHV-Ⅰ參考株處于同一個大的分支上，而韓國新型毒株和臺灣地區(qū)新型毒株分別處于另外兩個大的分支，說明12株分離株均為DHV-Ⅰ型。12株毒株分別處于不同小分支，說明分離株之間親緣關系近，但存在一定的地域差異。

3 ?小結與討論

小RNA病毒的結構蛋白VP1基因是病毒抗原性的主要決定成分。DHV-Ⅰ的VP1基因編碼的蛋白位于病毒核衣殼表面，能誘導動物產(chǎn)生中和抗體， DHV-Ⅰ VP1基因的核苷酸序列是一個高度可變區(qū)，其基因結構和功能仍未明確，分析這個高變區(qū)對DHV遺傳變異的研究有指導意義[8-10]。

本研究測定的12株I型鴨肝炎病毒VP1基因序列長度為714 bp，編碼238個氨基酸。與參考株VP1基因的大小一致，應用DNA Star對所測毒株 VP1基因序列進行了同源性分析，并繪制了系統(tǒng)進化樹，結果顯示所測得12株DHV分離株的VP1 基因的核苷酸序列同源性為99.2%～100%，氨基酸序列同源性為97.9%～100%，而與參考毒株VP1基因序列的核苷酸序列的同源性為91.7%～95.8%，氨基酸序列同源性為94.5%～98.3%。系統(tǒng)進化樹顯示共有3個分支，12株DHV分離株均與DHV-Ⅰ處于同一分支，親緣關系近;而與新型變異株臺灣地區(qū)株以及韓國株處在不同分支，親緣關系較遠。結果表明試驗所分離的DHV毒株為一個群，都屬于DHV-I。另試驗結果比對分析表明，12株分離株均存在核苷酸和氨基酸的點突變，氨基酸的點突變可以引起病毒抗原性的變化，分析這些點突變有助于研究病毒基因結構中決定毒力的基因位點。而分離株VP1基因核苷酸序列中的某些點突變并沒有引起氨基酸的變化，說明病毒表型變化程度低于遺傳變異程度[11]。

本研究從基因水平上研究病毒遺傳變異情況，分析其基因型，揭示與其他毒株的親緣關系，為該病在流行病學、亞單位疫苗研制和預防控制方面的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 邵澤香，韋 ?強，鮑國連，等.Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒RT-PCR檢測方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2009，21（5）：434-438.

[2] 何冉婭，于 ?淼，張玉玲，等.2007～2009年華南地區(qū)鴨肝炎病毒流行病學調(diào)查及分離株的VP1基因變異分析[J].中國動物傳染病學報，2010，18（1）：7-15.

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[4] 張艷芳，羅 ?薇，劉內(nèi)生，等.鴨肝炎病毒的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（7）：171-175.

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[9] LIU G Q， WANG F， NI Z，et al. Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type I （DHV-I） isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J]. Virus Research，2008，137（1）：137-141.

[10] TSENG C H， TSAI H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J]. Virus Research，2007，126（1-2）：19-31.

[11] 邵澤香，韋 ?強，鮑國連，等.鴨肝炎病毒浙江分離株全基因組測序及其VP1基因的序列分析[J].中國獸醫(yī)學報，2010，30（8）：1052-1055.

（責任編輯 ?曾德芳）

2.3 ?VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對分析

與參考毒株相比，12株分離株均存在散在點突變現(xiàn)象，氨基酸也存在少數(shù)點突變，但沒有插入和缺失現(xiàn)象。分離株與參考株的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在第49位12株分離株全部為S，與弱毒株A66相同，而強毒株161/79/V為T，推測12株分離株為弱毒株。此外，12株分離株之間也有散在堿基和氨基酸的點突變，在139、214、354、382、471、523、560、577、676 bp位置共有9處堿基位點出現(xiàn)點突變;而氨基酸突變位點有7個，位置在第47、72、128、175、187、193、226位，這些核苷酸和氨基酸位點為研究DHV基因結構中決定毒力的基因位點奠定了基礎。12株分離株與DHV-Ⅰ參考株之間的核苷酸變異區(qū)域部分圖解見圖4。

2.4 ?系統(tǒng)進化分析

用Mega軟件對12個分離株和參考株進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建（圖5），結果發(fā)現(xiàn)，12株分離株與DHV-Ⅰ參考株處于同一個大的分支上，而韓國新型毒株和臺灣地區(qū)新型毒株分別處于另外兩個大的分支，說明12株分離株均為DHV-Ⅰ型。12株毒株分別處于不同小分支，說明分離株之間親緣關系近，但存在一定的地域差異。

3 ?小結與討論

小RNA病毒的結構蛋白VP1基因是病毒抗原性的主要決定成分。DHV-Ⅰ的VP1基因編碼的蛋白位于病毒核衣殼表面，能誘導動物產(chǎn)生中和抗體， DHV-Ⅰ VP1基因的核苷酸序列是一個高度可變區(qū)，其基因結構和功能仍未明確，分析這個高變區(qū)對DHV遺傳變異的研究有指導意義[8-10]。

本研究測定的12株I型鴨肝炎病毒VP1基因序列長度為714 bp，編碼238個氨基酸。與參考株VP1基因的大小一致，應用DNA Star對所測毒株 VP1基因序列進行了同源性分析，并繪制了系統(tǒng)進化樹，結果顯示所測得12株DHV分離株的VP1 基因的核苷酸序列同源性為99.2%～100%，氨基酸序列同源性為97.9%～100%，而與參考毒株VP1基因序列的核苷酸序列的同源性為91.7%～95.8%，氨基酸序列同源性為94.5%～98.3%。系統(tǒng)進化樹顯示共有3個分支，12株DHV分離株均與DHV-Ⅰ處于同一分支，親緣關系近;而與新型變異株臺灣地區(qū)株以及韓國株處在不同分支，親緣關系較遠。結果表明試驗所分離的DHV毒株為一個群，都屬于DHV-I。另試驗結果比對分析表明，12株分離株均存在核苷酸和氨基酸的點突變，氨基酸的點突變可以引起病毒抗原性的變化，分析這些點突變有助于研究病毒基因結構中決定毒力的基因位點。而分離株VP1基因核苷酸序列中的某些點突變并沒有引起氨基酸的變化，說明病毒表型變化程度低于遺傳變異程度[11]。

本研究從基因水平上研究病毒遺傳變異情況，分析其基因型，揭示與其他毒株的親緣關系，為該病在流行病學、亞單位疫苗研制和預防控制方面的研究奠定了基礎。

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（責任編輯 ?曾德芳）

2.3 ?VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對分析

與參考毒株相比，12株分離株均存在散在點突變現(xiàn)象，氨基酸也存在少數(shù)點突變，但沒有插入和缺失現(xiàn)象。分離株與參考株的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在第49位12株分離株全部為S，與弱毒株A66相同，而強毒株161/79/V為T，推測12株分離株為弱毒株。此外，12株分離株之間也有散在堿基和氨基酸的點突變，在139、214、354、382、471、523、560、577、676 bp位置共有9處堿基位點出現(xiàn)點突變;而氨基酸突變位點有7個，位置在第47、72、128、175、187、193、226位，這些核苷酸和氨基酸位點為研究DHV基因結構中決定毒力的基因位點奠定了基礎。12株分離株與DHV-Ⅰ參考株之間的核苷酸變異區(qū)域部分圖解見圖4。

2.4 ?系統(tǒng)進化分析

用Mega軟件對12個分離株和參考株進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建（圖5），結果發(fā)現(xiàn)，12株分離株與DHV-Ⅰ參考株處于同一個大的分支上，而韓國新型毒株和臺灣地區(qū)新型毒株分別處于另外兩個大的分支，說明12株分離株均為DHV-Ⅰ型。12株毒株分別處于不同小分支，說明分離株之間親緣關系近，但存在一定的地域差異。

3 ?小結與討論

小RNA病毒的結構蛋白VP1基因是病毒抗原性的主要決定成分。DHV-Ⅰ的VP1基因編碼的蛋白位于病毒核衣殼表面，能誘導動物產(chǎn)生中和抗體， DHV-Ⅰ VP1基因的核苷酸序列是一個高度可變區(qū)，其基因結構和功能仍未明確，分析這個高變區(qū)對DHV遺傳變異的研究有指導意義[8-10]。

本研究測定的12株I型鴨肝炎病毒VP1基因序列長度為714 bp，編碼238個氨基酸。與參考株VP1基因的大小一致，應用DNA Star對所測毒株 VP1基因序列進行了同源性分析，并繪制了系統(tǒng)進化樹，結果顯示所測得12株DHV分離株的VP1 基因的核苷酸序列同源性為99.2%～100%，氨基酸序列同源性為97.9%～100%，而與參考毒株VP1基因序列的核苷酸序列的同源性為91.7%～95.8%，氨基酸序列同源性為94.5%～98.3%。系統(tǒng)進化樹顯示共有3個分支，12株DHV分離株均與DHV-Ⅰ處于同一分支，親緣關系近;而與新型變異株臺灣地區(qū)株以及韓國株處在不同分支，親緣關系較遠。結果表明試驗所分離的DHV毒株為一個群，都屬于DHV-I。另試驗結果比對分析表明，12株分離株均存在核苷酸和氨基酸的點突變，氨基酸的點突變可以引起病毒抗原性的變化，分析這些點突變有助于研究病毒基因結構中決定毒力的基因位點。而分離株VP1基因核苷酸序列中的某些點突變并沒有引起氨基酸的變化，說明病毒表型變化程度低于遺傳變異程度[11]。

本研究從基因水平上研究病毒遺傳變異情況，分析其基因型，揭示與其他毒株的親緣關系，為該病在流行病學、亞單位疫苗研制和預防控制方面的研究奠定了基礎。

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（責任編輯 ?曾德芳）