復合微生物發酵棉稈制備植物栽培基質的培養基優化

周安盛+楊苗+王常高+杜馨+林建國+蔡俊

摘要：利用固氮菌、酵母菌和高產纖維素酶的細菌，采用混菌固態發酵的方式，以制備的植物栽培基質中蛋白質的含量為衡量指標，對棉稈發酵培養基進行優化。結果表明，在最優培養基為棉稈4.7 g，椰樹果殼粉0.3 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.1 g，尿素1.72 g，磷酸氫二鉀0.304 g，水35 mL時，制備的植物栽培基質蛋白質含量達到29.08%，與發酵前（19.80%）相比提高了9.28個百分點。

關鍵詞：棉稈;復合微生物;蛋白質;發酵;優化

中文分類號：Q939.96 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5241-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.050

Optimizing Medium of Preparing Plant Cultivation Matrix with Compound Microbial Fermentation of Cotton Stalk

ZHOU An-sheng， YANG Miao， WANG Chang-gao， DU Xin， LIN Jian-guo， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Using azotobacter， yeasts and bacteria with high-yield cellulose， mixed solid-state fermentation， response surface methodology， the fermentation medium of preparing plant cultivation matrix was optimized. The results showed that the optimal fermentation medium was 4.7 g cotton stalk， coconut shell powder 0.3 g， peptone 0.8 g， yeast powder 0.1 g， urea 1.72 g， potassium hydrogen phosphate 0.304 g， and water 35 mL. Under the optimal medium， content of protein reached 29.08%， increasing by 9.28 compared with the content of protein （19.80%） before the fermentation.

Key words： cotton stalk; Compound microbial; protein; fermentation; optimization

我國是產棉大國，據統計2007年全國棉花種植面積達592萬km2，棉花總產量達762.4萬t[1]，棉花秸稈總產量約為3 000萬t。棉花是新疆的支柱性產業之一，新疆棉花種植面積約占全國的1/3，棉稈資源相當豐富。目前，該地區棉稈除少量用于造紙、制板、建筑和飼料生產[2-4]等外，剩下的大部分直接還田、焚燒或者就地掩埋。造成以上現狀主要是因為棉稈含豐富的韌皮纖維和大量的木質纖維素，木制化程度高，牲畜適口性差，消化率低，用一般技術處理難以達到飼用標準，較少用于飼料，因而多被廢棄。尤其是在農村，廣大種植戶無法將棉稈作為有機肥直接還田，就將棉稈進行焚燒，產生大量的CO2等氣體，給生態環境帶來污染，造成資源的浪費。由于產棉區氣候干燥，棉花秸稈密實，難以腐蝕，就地掩埋的棉稈不能及時變為肥料，會增加土壤的負擔，使肥力下降[5]。

棉稈的處理在生產實踐上具有重要意義，方法大致分為以下幾類：生物發酵[6-8]、化學法、物理化學法。常見的用途有作為反芻動物的飼料[9，10]，制作養殖業中的發酵床，發酵棉稈還在農業和沼氣生產等方面有一定應用[11]。近年來，有機生態型無土栽培已成為中國無土栽培發展的主要形式。有機基質因其理化性質穩定，供肥充足，來源廣泛，成本低廉，被廣大農民接受，因此對基質的需求量連年增加[12]。目前關于油菜、玉米、小麥等秸稈的研究報道較多[13，14]。前人對棉稈的基質配比進行了較多研究，如崔元玗等[15]研究了棉稈栽培番茄的最佳基質配方，王芳等[16]對雙孢蘑菇的棉稈栽培配方進行了研究，但是對發酵棉稈制備無土栽培基質的培養工藝的研究鮮有報道。

本研究利用固氮菌、酵母菌和高產纖維素酶的細菌，采用混菌固態發酵的方式，以制備的植物基質中蛋白質的含量為衡量指標，對棉稈發酵培養基進行優化，為以棉稈作原料發酵制備植物栽培基質的工藝提供指導。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

固氮菌、啤酒酵母、熱帶假絲酵母、弗氏埃希氏菌，均由本實驗室保藏。

棉稈、椰樹果殼：由湖北省農業科學院經濟作物研究所提供。棉稈經白腐菌預處理一個月，滅菌，烘干，粉碎至20～60目。椰樹果殼經清洗，烘干，粉碎至20～60目。麩皮、大豆粉、玉米粉、大米粉均為市售。

1.2 ?培養基

1）斜面和種子培養基（種子培養基加瓊脂2%）。固氮菌：甘露醇1%、磷酸二氫鉀0.02%、硫酸鎂0.02%、氯化鈉0.02%、硫酸鈣0.01%、碳酸鈣 0.5%。酵母：葡萄糖2%、酵母膏1%、蛋白胨2%。細菌：蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%。

2）初始混菌固態發酵培養基：棉稈5 g、蛋白胨1 g、酵母粉0.3 g、氯化銨2 g、硫酸銨2 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.2 g、水35 mL。

1.3 ?方法

1.3.1 ?蛋白質含量的測定 ?采用恒重法[16]去除待測試樣的水分，冷卻，研磨備用。準確稱取均勻試樣0.5 g，置于100 mL燒杯中，加25 mL水，煮沸加入100 g/L硫酸銅溶液10 mL，25 g/L氫氧化鈉溶液10 mL，間歇性攪拌，放置1 h。定性濾紙抽濾，用60～80 ℃的熱水洗滌沉淀3次，用10 g/L氯化鋇溶液5滴和2 mol/L鹽酸溶液1滴，檢驗濾液至不生成白色沉淀為止。將濾紙和沉淀一起在65 ℃條件下烘干至恒重。采用半微量凱氏定氮法測定蛋白質含量[16]。1.3.2 ?種子液的制備和固態發酵條件 ?將上述50 mL種子培養基分裝于250 mL的三角瓶中，121 ℃，20 min滅菌，分別接入已活化的菌株，固氮菌于32 ℃，180 r/min，培養20 h;酵母于30 ℃，180 r/min，培養20 h;細菌于37 ℃，180 r/min，培養10 h，即可制得處于對數生長期中期的種子液。在發酵開始時，先接入固氮菌1.2 mL，24 h后接入兩株酵母菌和細菌各0.6 mL，總計接種量3 mL。34 ℃靜置培養96 h。

1.3.3 ?發酵培養基的優化 ?采用Plackett-Burman（PB）試驗設計，對主輔料添加量、硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂5個因素進行顯著性分析。每個因素根據初始發酵培養基的組分水平，分別選取高水平（+）和低水平（-）進行試驗。PB試驗的因素和水平見表1。PB試驗相關設計、數據分析以及模型的建立均使用MinitabTM軟件完成。最陡爬坡試驗是根據PB試驗結果，按照顯著性因素的變化效應，進一步確定因素水平，為后續響應面選擇合適的中心試驗點。最陡爬坡試驗的原點和變化步長見表2。

響應面（RSM）分析方法是利用合理的試驗設計并通過試驗得到一定數據，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來確定最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。按照中心復合試驗設計（CCD），選取PB試驗得到的顯著性因素進行研究，以蛋白質含量為衡量指標，進行響應面分析和預測，獲得發酵培養基的最優組成。中心復合試驗設計、響應面分析以及模型的建立和預測均使用Design-Expert v8.0.6.1軟件完成。CCD試驗設計中的因素和水平見表3。

2 ? 結果與分析

2.1 ?Plackett-Burman（PB）試驗結果

表4是Plackett-Burman（PB）試驗的結果，根據對試驗結果的方差分析和5個因素的標準化效應的Pareto圖（圖1）可以看出，硫酸銨、尿素和磷酸氫二鉀均對發酵棉稈中蛋白質含量有顯著性影響，P值分別為0.025、0和0.031，而主輔料和硫酸鎂則為非顯著性因素。因此，對硫酸銨、尿素和磷酸氫二鉀進行最陡爬坡試驗，對主輔料、硫酸鎂、蛋白胨和酵母粉進行最低添加量試驗。

2.2 ?最陡爬坡試驗結果

根據Plackett-Burman（PB）試驗結果，進行最陡爬坡試驗，試驗序和結果見表5。隨著試驗的進行，棉稈中蛋白質含量緩慢上升，在第五組試驗時達到峰值，為26.957%。因此，尿素和磷酸氫二鉀分別選取2 g和0.2 g作為CCD試驗的中心點。

2.3 ?非顯著因素最低添加量試驗結果

棉稈蛋白質含量與非顯著因素添加量的關系見圖2。由圖2可知，通過單因素試驗，確定了主輔料添加量為4.7 g和0.3 g，其中輔料果殼粉的添加量為0.3 g，同時硫酸鎂、蛋白胨和酵母粉的添加量為0、0.8、0.1 g。

2.4 ?中心復合設計試驗和響應面分析

尿素和磷酸氫二鉀兩個顯著性因素進行中心復合設計試驗的運行序和結果見表6。對結果進行方差分析并進行二次二元回歸擬合，得到方程為Y=28.773-0.331X1+0.676X2+0.013X1X2-0.576X12-0.324X22，該方程中Y為蛋白質含量（%）的預測值，X1和X2分別為尿素和磷酸氫二鉀的編碼值。此模型的F值為28.06，說明此模型是顯著的。其中X1（P=0.009 5）、X2（P=0.000 2）、X12（P=0.000 7）和X22（P=0.014 3）呈顯著性影響，同時X1 X2的P值為0.923 2，大于0.05，為不顯著項。此方程的R2達到了0.937 1，說明此方程具有較好的擬合度。此方程的3D響應面圖和等高線圖見圖3。采用脊嶺分析（圖4），預測通過發酵棉稈得到最高的蛋白質含量為29.168 7%，此時編碼值X1、X2分別取-0.28和1.04，對應的尿素取1.72 g和0.304 g。

對上述發酵棉稈最優化培養基組分進行驗證性試驗，結果蛋白質含量的平均值為29.08%，與模型預測值基本一致，說明該模型的建立是合理的。

3 ?結論

綜合上述試驗結果，混菌固態發酵棉稈制備植物栽培基質的最優培養基的組分：棉稈4.7 g，椰樹果殼粉0.3 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.1 g，尿素1.72 g，磷酸氫二鉀0.304 g，水35 mL。在優化的培養基條件下，蛋白質含量達到29.08%，與發酵前（19.80%）相比提高了9.28個百分點。

有關發酵農作物秸稈提高其基質粗蛋白質含量的研究已有較多報道，但大多是涉及霉菌和酵母菌或者白腐菌和酵母菌的混菌發酵過程。李海紅等[18]將從牛胃中篩選出的菌株和假絲酵母共同發酵玉米秸稈，粗蛋白含量提高了13%左右。楊柳燕等[19]對水生植物發酵產物蛋白質含量進行了研究，最高粗蛋白含量達到了39.88%。潘鋒等[20]用2株真菌、3株酵母與白地霉共培養發酵稻草，最終粗蛋白質含量達到了19.37%。以上研究是關于粗蛋白飼料方面的應用，而本試驗研究了固氮菌、酵母菌和產纖維素酶細菌混菌固態發酵棉花秸稈制備植物栽培基質的培養基組分，以蛋白質含量為衡量指標，其中，利用產纖維素酶的細菌替代傳統的霉菌和白腐菌，能夠簡化工藝，縮短發酵時間，提高效率，同時加入的固氮菌能夠增加基質中氮的含量。本研究成果作為植物栽培基質的主料，在實際應用之前，還需要進行壓縮比、吸水率等相關性質的研究，同時，添加其他植物栽培所需營養物質和生物膠的復配試驗和放大試驗等也需要進一步研究。

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（責任編輯 ?趙 ?娟）

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