大鯢皮膚分泌物氣味成分分析及脫臭方法研究

徐偉良，陳德經(jīng)

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001;2.陜西理工學(xué)院，陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中723001)

大鯢(Andrias davidianus)屬于大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科［1］。大鯢皮膚分布有顆粒腺和粘液腺，當(dāng)機(jī)體受到外界不良刺激時(shí)，能分泌白色粘稠狀液體，并帶有一定特殊性臭味［2］。自然界中，生物體經(jīng)常通過(guò)自身分泌的氣味來(lái)進(jìn)行生物信息傳遞和交換，特別是在避敵、引誘、覓食、導(dǎo)航以及維持群居的動(dòng)物社會(huì)等方面氣味的作用尤為突出［3］。動(dòng)物氣味主要源于氣味腺、唾液、尿和糞便等，其成分包括烷烴類、烯烴類、酯類、醛類、酮類、醇類、有機(jī)酸、脂肪族胺類及芳香化合物等［4－5］，其中己醛、己醇、硬脂醇、十六烷酸和脂肪族胺類成分在動(dòng)物氣味中較為常見(jiàn)［6－7］。目前，檢測(cè)揮發(fā)性氣味最常用的方法有氣相色譜法(GC)、氣－質(zhì)聯(lián)用法(GCMS)和氣體光譜分析法，在分析測(cè)定前常常采用固相微萃取法、吹掃捕集法及頂空氣體捕集法等的對(duì)氣味進(jìn)行采集［8－9］。動(dòng)物氣味大多都有毒性，其中還有一些揮發(fā)性有機(jī)酸、脂肪族胺類以及含硫揮發(fā)性成分，具有特殊的氣味特征［5］。動(dòng)物氣味中呈現(xiàn)臭味是通過(guò)發(fā)臭基團(tuán)(如硫基、羰基等)刺激嗅覺(jué)細(xì)胞，使人感到厭惡和不愉快［10－11］。臭味物質(zhì)主要成分有硫醇類、硫醚類、硫化氫、氨、胺類和吲哚類等，如甲硫醇、甲硫醚、二甲基二硫醚、二硫化碳和碳基硫等［12－13］。

大鯢皮膚分泌物具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等活性作用［14－15］，是天然藥物資源開(kāi)發(fā)的豐富來(lái)源，可通過(guò)活體人工采集進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。但是大鯢皮膚分泌物中的特殊性臭味物質(zhì)及其毒性，目前尚未見(jiàn)報(bào)道，這對(duì)于其利用受到限制。因此，要合理利用大鯢皮膚分泌物資源，有效脫去分泌物中的臭味是非常必要的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑。活體大鯢，由陜西漢源生物科技有限公司提供;酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶，購(gòu)自西安－沃爾森生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器。GC6890N/MSD5973N聯(lián)用儀(Agilent公司);DZF－6050型真空干燥箱(上海－恒科技有限公司);LC－800低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);FA2004N電子天平;KQ－100DA超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);601超級(jí)水浴(江蘇－瑞華儀有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鯢皮膚分泌物氣體成分分析。

1.2.1.1 機(jī)械刺激分泌物。采用機(jī)械刺激法收集大鯢皮膚分泌物。用軟毛刷輕輕拍打或按摩大鯢背部、尾部等皮膚分泌腺較多部位，對(duì)其進(jìn)行溫和刺激，使大鯢分泌產(chǎn)生白色分泌物，并刮取分泌物，裝入大鯢分泌物收集瓶中。

1.2.1.2 靜態(tài)頂空法收集氣體。將氣體采集瓶松開(kāi)瓶蓋，用熱風(fēng)機(jī)加熱，排除內(nèi)部瓶中空氣，迅速放入5 g分泌液于收集瓶中，旋緊瓶蓋，在－20℃冷凍條件下保存。檢測(cè)時(shí)，將樣品瓶置于恒溫水浴鍋內(nèi)平衡一段時(shí)間，使其上部頂空的氣體與樣品中的組分達(dá)到相平衡，然后用采樣器抽取瓶頂空的氣體，迅速注入色譜儀的進(jìn)樣室中進(jìn)行色譜分析［16］。

1.2.1.3 氣體檢測(cè)方法［17－18］。

(1)色譜條件。色譜柱:HP－5(30.00 m ×0.32 mm ×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱;程序升溫:以4℃/min的升溫速率由80℃程序升溫至290℃，恒溫30 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;載氣(He)流量為1.0 ml/min。

(2)質(zhì)譜條件。傳輸線溫度:280℃;MSD離子源為EI源，離子源溫度為230℃;四極桿溫度為150℃;電子能量:70 eV;質(zhì)量掃描范圍(m/z)為35～350。

(3)氣體檢測(cè)。將氣體采樣器注入氣質(zhì)聯(lián)用儀中，進(jìn)行分析檢測(cè)，然后將檢測(cè)結(jié)果與美國(guó)NIST05譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定氣質(zhì)聯(lián)用儀分析的氣體成分。

1.2.2 大鯢皮膚分泌物脫臭處理方法研究。

1.2.2.1 乙醇脫臭。取5 g大鯢皮膚分泌分泌物于三角瓶中，加入20 ml 95%乙醇震蕩洗滌30 min，過(guò)濾，將分泌物烘干，真空濃縮乙醇回收，真空干燥上清液和不溶物，感官評(píng)價(jià)氣味，采用GC-MS方法檢測(cè)氣體成分。

1.2.2.2 酶法脫臭。分別取5 g大鯢皮膚分泌分泌物加入5個(gè)50 ml三角瓶中，并加入50 ml去離子水，超聲30 min溶解，分別加入0.5%堿性蛋白酶，pH 9;0.5%酸性蛋白酶，pH 3;0.5%胰蛋白酶，pH 8，0.5% 胃蛋白酶，pH 5，水浴溫度 35℃，2 h。酶解物經(jīng)過(guò)85℃ 30 min滅酶，離心分離，分別對(duì)上清和不溶物真空干燥，感官評(píng)價(jià)氣味，采用GC-MS方法檢測(cè)氣體成分。

1.2.2.3 活性炭脫臭。取5 g大鯢皮膚分泌物加入含50 ml去離子水的三角瓶中，分別取活性炭與綠茶各1 g，包裹于紗布中，放入三角瓶?jī)?nèi)密封保持48 h，真空干燥，感官評(píng)價(jià)氣味，采用GC-MS方法檢測(cè)氣體成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢皮膚分泌物氣體成分的檢測(cè)結(jié)果 大鯢皮膚分泌物揮發(fā)性成分的GC－MS色譜圖如圖1所示。

圖1 大鯢皮膚分泌物氣體GC/MS總離子流色譜圖譜

與美國(guó)NIST05譜庫(kù)比對(duì)，大鯢分泌物中揮發(fā)性氣體成分見(jiàn)表1。由表1可知，共檢測(cè)出10種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括二甲基二硫醚(C2H6S2)、CO2和8種脂類化合物。CO2可能為氣體收集時(shí)捕集的空氣中成分;二甲基二硫醚是一種有機(jī)硫化物，有惡臭，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚和烴類，易分解，毒性較低，僅為乙硫醇毒性的0.1%［19］。其余8種成分為脂類化合物，無(wú)臭味，無(wú)毒性。

表1 大鯢皮膚分泌物氣體成分

2.2 大鯢皮膚分泌物脫臭處理結(jié)果 由表2可知，通過(guò)對(duì)乙醇脫臭、酶解脫臭、活性炭脫臭方法進(jìn)行比較，大鯢皮膚分泌物經(jīng)乙醇脫臭后真空干燥后無(wú)異味，GC－MS未檢出二甲基二硫醚;胃蛋白酶酶解皮膚分泌物真空干燥后，無(wú)臭味而有鮮香味，GC－MS未檢出二甲基二硫醚，其他幾種酶水解后有臭味，未做二甲基二硫醚的GC－MS檢測(cè);活性炭脫臭后仍有臭味，GC－MS檢出二甲基二硫醚。

表2 大鯢皮膚分泌物的脫臭效果

3 討論

大鯢皮膚分泌物具有特殊性臭味和較強(qiáng)的粘性，是用于驅(qū)逐天敵的自我保護(hù)的機(jī)制。目前，對(duì)生物樣品的脫臭方法少見(jiàn)報(bào)道，一般對(duì)臭味的脫臭方法主要有物理脫臭、化學(xué)脫臭和生物脫臭法等［11，20］。但是，加入化學(xué)物質(zhì)脫臭和生物過(guò)濾脫臭及土壤脫臭方法，不僅影響分泌物的結(jié)構(gòu)和活性，且還會(huì)造成除去這些物質(zhì)的困難而使工藝復(fù)雜化，因此并不適用該試驗(yàn)中大鯢分泌物的除臭操作。此外，歐陽(yáng)昌榮等［21］報(bào)道通過(guò)堿性乙醇洗滌和減壓脫臭的方法能較好地脫去魚油中的臭味。對(duì)分泌物的氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析表明，臭味氣體成分為二甲基二硫醚，具有低毒性，易溶于乙醇、乙醚，易分解的性質(zhì)。因此，根據(jù)大鯢分泌物的性質(zhì)，采用乙醇脫臭、活性炭脫臭及酶解脫臭的方法，并利用真空干燥輔助脫臭，能簡(jiǎn)單有效地脫去分泌物中的臭味成分，并保持分泌物的營(yíng)養(yǎng)成分不會(huì)損失，有利于分泌物的充分利用。分泌物脫臭方法比較結(jié)果表明，乙醇脫臭效果最佳，二甲基二硫醚溶解乙醇，真空濃縮及干燥時(shí)被抽出，無(wú)臭味，并經(jīng)GC－MS未檢出二甲基二硫醚。胃蛋白酶水解分泌物脫臭，使分泌物蛋白在酶的作用下，水解產(chǎn)生多肽等小分子鮮味物質(zhì)，有利于臭味成分的去除并增加其鮮香味。在活性炭脫臭過(guò)程中，為避免活性炭與分泌物接觸后不易分離，從而使活性炭并不能充分吸附分泌物內(nèi)部臭味成分，脫臭效果略差。

大鯢皮膚分泌物揮發(fā)氣味成分為二甲基二硫醚和8種脂肪酸。大鯢皮膚分泌物經(jīng)過(guò)乙醇脫臭和酶解脫臭后，無(wú)臭味，2種脫臭方法均未檢出二甲基二硫醚，能夠有效除去其中二甲基二硫醚有毒成分，有利于大鯢食用時(shí)去除其中的有害成分，并為大鯢資源的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

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