垂枝櫻花外植體滅菌及不定芽的誘導研究

王紅梅，李園莉，李洪光，董曉輝

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇句容212400;2.嘉漢城市生態苗木(蘇州)有限公司，江蘇蘇州215028)

櫻花泛指嗇薇科(Rosaceae)，李亞科(Prunoidea)，櫻屬(Cerasus)觀賞植物，共120余種，是世界著名的木本花卉，櫻花主要分布于亞洲的中國、日本和朝鮮。我國古老的西南部高山地區為櫻屬植物的分布中心、原始種保存中心和特有中心，蘊藏著近30種野生櫻花類群，其中很多具有較高的觀賞價值［1］。

我國現有櫻花45種，主要有冬櫻花、櫻花、福建山櫻花、云南早櫻、垂枝櫻花等［2］。其中，垂枝櫻花(Cerasus subhirtella Miq.var.pendula Tanaka.)，樹皮灰褐色，冬芽卵形，鱗片先端有疏毛，葉片卵形至卵狀長圓形，葉邊有鋸齒或缺刻狀鋸齒，葉柄、托葉和鋸齒常有腺體，傘房狀或短總狀花序，花瓣白色或粉紅色，先端圓鈍、微缺或深裂，花期4月，果期6月。產于浙江、安徽、江西、四川、臺灣省等地，原種產于日本［3］。

觀賞櫻花的引種栽培自20世紀70年代引起人們的重視，世界各地廣泛栽培櫻花，尤其在日本被奉為國花［2］。隨著園林化城市的建設，櫻花苗木供不應求，傳統的繁殖方法繁殖速度慢，不能滿足市場的需求，影響了花農的經濟效益和櫻花的種植面積［3－4］，而組織培養具有用材少、見效快、可以周年生產等優良特點，成為優良品種快速繁殖的有效途徑。

為進一步開發利用我國的櫻花資源，擴大種植范圍，形成規模和影響，筆者初步探討垂枝櫻花的外植體滅菌及不定芽誘導的相關技術，旨在為垂枝櫻花的組織培養提供相關技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為櫻花品種“垂枝櫻花”，3～9月分別選取當年生帶腋芽莖段，來源于江蘇句容天王鎮嘉潤苗圃。

1.2 方法

1.2.1 材料采集與預處理。在晴朗天氣條件下，截取垂枝櫻花健壯無病害嫩枝中上部作為外植體，去掉葉片留葉柄。選擇生長健壯、無病蟲害的春梢枝段為材料，對所采材料及時接種，防止失水萎蔫或污染霉爛。

將采集的櫻花材料進行修整，去掉不需要的部分，剪切成2～3 cm小段，每段至少保留1～2個腋芽，然后將材料放在洗衣粉中浸泡15 min，用流水反復沖洗1 h。

1.2.2 材料表面滅菌。對材料進行預處理后，轉入超凈工作臺進行消毒處理。把外植體剪成1～2 cm長的莖尖或帶有一個腋芽的莖段，用70%乙醇處理30 s，然后用0.1%的HgCl2消毒處理 4、5、6、7、8、10、12 min，處理期間不斷搖晃，使材料充分達到滅菌效果，再用無菌水沖洗3～4遍。接種前部分切去莖段的兩端，將消毒好的材料剪切成單芽，保留莖段長約1 cm左右，直立式接種，將外植體基部插入培養基，每瓶接種3個材料，每個處理接種20瓶，重復3次，20 d后分別統計污染率、褐變率、成活率等指標［5－6］。

1.2.3 外植體不同采集時間的影響。選取3～9月，晴天中午采集當年生健壯的外植體，接種于相同的啟動培養基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L 上進行培養，接種20 d后，統計成活率及生長狀況。

1.2.4 不定芽誘導培養。選擇3個試驗因素，分別為基本培養基(MS、1/2MS、1/4MS)、6-BA(0.1、0.5、1.0 mg/L)、NAA(0.02、0.05、0.10 mg/L)，采用 L9(34)正交設計，共 9 種配方，每種培養基里均附加蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH調至5.8。每種處理接種30瓶，每瓶2棵，重復3次，30 d后統計分化數和分化率［6］。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間的影響 對垂枝櫻花不同滅菌時間的比較見表1。表1表明，在對外植體表面乙醇滅菌時間均為30 s的情況下，HgCl2滅菌時間過低會導致污染率上升，相反，時間控制在8～12 min，褐變率和污染率較低，存活率最高達到68.3%。此外，滅菌時間也隨采集外植體母株的生長狀態及芽的生長狀況而調整。芽較嫩時，滅菌時間相對縮短，否則滅菌時間過長會導致褐變甚至直接殺死材料，但滅菌時間過短會使污染率大大上升，污染率過高將致使成活率接近0［6］。

表1 垂直櫻花表面滅菌效果比較

2.2 外植體不同采集時間的影響 圖1表明，外植體采集時間以3～5月份的萌芽率較高，6～8月份較低，9月又有所升高。4月份采集外植體的成活率最高，達到84%，這是因為3月份垂枝櫻花期過后，正處于快速的營養生長期，不定芽的誘導較易。而6月份后，由于氣溫不斷升高，枝條的木質化加速，影響了不定芽的誘導。9月份屬于樹木的秋季生長期，又有所增加，但萌芽率遠不如春季。而10月份后到翌年2月份，由于落葉及花芽的形成，基本不適合采集莖段外植體。因此，以莖段為外植體進行組織培養適宜的材料采集時間為每年3～5月份。

圖1 外植體采集時間與萌芽率的關系

2.3 不定芽誘導結果分析 表2表明，基本培養基以大量元素減半的1/2MS基本培養基的分化率最高;隨著6-BA濃度的增加，分化率呈先增后減的趨勢;NAA濃度為0.02 mg/L與0.05 mg/L的分化率差別不大，而0.10 mg/L的分化率最高。從R值可知，3種因素對試驗結果的影響為基本培養基＞NAA＞6-BA。所試驗的配方中以啟動培養基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L 較適宜［6－7］。但考慮到啟動培養中僅選擇了3個因素的3個水平進行試驗，各水平間是否存在差異，必須進行方差分析。

表2 不同培養基對啟動培養的影響

方差分析結果表明，基本培養基的F=90.976，P=0.011＜0.05，NAA 的 F=21.086，P=0.045 ＜0.05，表明這 2 個因素對分化率的影響都達到顯著水平。因此，需對這2個因素進行多重比較。使用SPSS19.0中Duncan法進行多重比較，結果表明，3種基本培養基之間均達到顯著差異;NAA的第1個和第2個水平間差異不顯著，而與第3個水平間存在顯著差異。再結合極差分析結果，初步得到適宜垂枝櫻花不定芽誘導的培養基為 1/2MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L。由于6-BA的各水平間差異不顯著，所以在進一步試驗中可加大6-BA各水平的差異，以便尋找分化率更高、生長效果更好的誘導培養基。

3 討論

木本植物組織培養中，初次培養的褐變死亡是普遍存在的問題，在櫻花培養中也如此，材料年齡、取材部位，材料大小、培養條件以及外植體受傷害程度等均能對褐變產生影響，目前尚無徹底的解決辦法［8］。

研究表明，選擇適當的外植體以及控制表面滅菌時間是克服材料褐變的最主要手段，取材長度適當加大，盡可能減小傷口面積，并縮短切口暴露在空氣中的時間，選擇合適的消毒劑和消毒時間，如乙醇雖消毒效果較好，但易對材料造成傷害，導致褐變，HgCl2對外植體傷害較輕，且消毒時間越長，消毒效果越好［9］。

在組培過程中，污染問題也是影響外植體死亡的最重要因素之一，在組培生產過程中，污染主要來源4個方面:①植物材料污染;②培養基污染;③接種過程發生污染;④培養過程發生污染。針對污染發生的來源，加強控制以降低污染，認真對待表面滅菌過程，降低污染率，對真菌引起的污染材料，不能再轉接，對細菌引起的污染可轉入生根，但要單獨轉接，防止與其他材料發生交叉感染［10］。

在不定芽誘導的培養中，腋芽分化的發生也受到多種因素的影響，除受培養基成分、培養條件等影響外，還受生長素濃度的影響。該試驗中僅對基本培養基和2種生長素的濃度進行了試驗，分化率有待進一步提高。所以，在進一步研究中可分別對基本培養基的種類、培養條件以及附加成分進行試驗，以達到較好的分化效果［6］。

［1］段曉梅.櫻花繁殖綜述［J］.思茅師范高等?？茖W院校報，2002，18(3):8－20.

［2］曹光球.觀賞櫻花繁殖技術研究進展［J］.西南林學院學報，2007，27(6):5 －8.

［3］冷天波，李樂輝，柴德勇，等.櫻花組織培養育苗技術［J］.河南林業科技，2011，31(3):10 －14.

［4］汪結明，李瑞雪，魏萬亮，等.垂枝櫻花的觀賞特性及其園林應用研究［J］.中國園藝文摘，2011(15):61 －63.

［5］王玉珍，徐進，羅景蘭，等.草櫻花組培快繁技術的研究［J］.山東農業科學，2004(6):47 －60.

［6］王紅梅.4種臺灣青棗組培技術研究［J］.西部林業科學，2008(4):65－70.

［7］朱廣廉.植物組織培養中外植體滅菌［J］.植物生理學通訊，1996，32(6):444－449.

［8］王文房，李修嶺.櫻花花柄的組織培養［J］.安徽農業科學，2006，34(22):5839 －5841.

［9］徐楠.福建山櫻花組織培養技術研究［D］.福州:福建農業大學，2008.

［10］鄒娜，曹光球，林思祖.觀賞櫻花繁殖技術研究進展［J］.西南林學院學報，2007，27(6):42 －46.