正交設計優化青莢葉中植物甾醇的提取工藝

張寒，李鋒麗，馬亞榮，劉文娟，楊光華，譚汗青，文和，張蓉，杜強

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

青莢葉(Helwingia japonica)為山茱萸科青莢葉屬，因花著生于葉上面的中脈(近于基部)，又稱葉上珠、葉上花。其根莖葉入藥，具有舒筋活絡、調經、清熱除濕、解毒消腫、涼血止血、清肺止咳等功效，并具有清熱利尿、下乳等功能［1］。青莢葉中含有的植物甾醇類成分是植物中的一種活性成分，在結構上與動物性甾醇如膽甾醇相似，是一種類似于環狀醇結構的物質，有降低膽固醇的作用［2］，然而針對青莢葉中植物甾醇的研究在國內卻是很少見的。

植物甾醇提取及定量分析方法的研究報道［3-5］很多，本實驗采用磷硫鐵作為顯色劑［5］測定青莢葉中植物甾醇的含量，采用正交實驗法，以豆甾醇的含量為指標，通過紫外分光光度法對青莢葉中植物甾醇的含量進行測定，優化青莢葉中皂化提取物的提取工藝。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

青莢葉，陜西眉縣太白山采用;豆甾醇(純度≥95%);乙醇、石油醚、氫氧化鉀、三氯甲烷、三氯化鐵、濃磷酸、濃硫酸等均為分析純。

UC-2102C/PC/PCS 型紫外可見分光光度計;GR202 微量天平;SENCOR 系列旋轉蒸發器;SXKW數顯控溫電熱套;SHZ-D(III)循環水式真空泵;KQ-300B 型超聲波清洗器;503N 型恒溫水浴鍋。

1.2 溶液配制

1.2.1 豆甾醇標準溶液配制 準確稱取豆甾醇標樣5 mg，溶于無水乙醇中，定容至10 mL，豆甾醇含量為0.500 mg/mL，貯于棕色瓶中，低溫保存備用。使用時吸取上述儲備液2.5 mL，用無水乙醇定容至25 mL，得豆甾醇使用液，含量為50 μg/mL。

1.2. 2 磷硫鐵顯色劑配制 稱取10 g FeCl3·6H2O 溶于85%濃磷酸中，用磷酸定容至100 mL。貯于棕色瓶中，冷藏，可保存1 年。再取上述配好的10% FeCl3液1.5 mL 于100 mL 棕色瓶中，用濃硫酸定容至刻度。

1.3 標準曲線的繪制［6-7］

取20 mL 干燥試管6 支編號，分別按表1 添加試劑。而后在室溫下顯色15 min，在445 nm 下用分光光度計分別測定吸光度，以豆甾醇量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。線性回歸，得回歸方程:Y=0.001 2X－0.007 1，相關系數R2=0.998 3，說明該方法線性良好。

表1 標準曲線試劑繪制參數Table 1 Stigmatization parameters of standard curve

紫外-可見分光光度計以標準曲線空白調基準，在350 ～700 nm 范圍內掃描，結果見圖1。

圖1 紫外吸收波譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum

由圖1 可知，在445 nm 和550 nm 處有2 個吸收峰，根據峰高我們選擇445 nm 作為測定吸收波長。

1.4 青莢葉提取［8］

稱取青莢葉細粉(過40 目篩)約10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入氯仿60 mL，加熱回流提取2 h，放冷，過濾，殘渣中再加氯仿60 mL，回流提取2 h，放冷，過濾。合并濾液，減壓濃縮至干。殘渣加入10%的氫氧化鉀乙醇溶液60 mL，于80 ℃回流皂化90 min，以石油醚萃取4 次，每次60 mL，合并有機相，揮干溶劑，得青莢葉提取物。

1.5 青莢葉中植物甾醇含量測定［9］

準確稱取提取物0.4 ～0.45 g，用無水乙醇溶解后定容至50 mL。取樣品液4 mL，加入無水乙醇4 mL，磷硫鐵顯色劑4 mL，搖勻，15 min 后用分光光度計在波長445 nm 處測定其吸光度。

2 結果與討論

2.1 青莢葉中甾醇最佳提取條件的確定

單因素實驗表明，料液比、KOH-乙醇濃度、皂化時間和萃取劑用量對甾醇的提取工藝影響最大。選用L9(34)正交表進行正交實驗，以確定提取甾醇的最佳工藝參數，因素水平見表2，結果見表3。

表2 因素水平Table 2 Factors and levels

表3 正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal test

由表3 可知，堿濃度對粗甾醇的提取率影響最大。最佳因素組合為A3B1C2D3，即提取不皂化物時，加入提取劑60 mL，料液比1 ∶6(g/mL)，氫氧化鉀-乙醇溶液濃度為10%，在溫度80 ℃下皂化90 min，此時甾醇的提取率最高。

2.2 正交實驗結果驗證

精密稱取3 份青莢葉藥材，在最佳條件下操作，平行制備3 份樣品溶液，每份測定3 次，取其平均值，結果見表4。

表4 青莢葉中植物甾醇的吸光度(n=3)Table 4 Absorbance of sterol from Helwingia japonica

由表4 可知，正交實驗優選出的最佳提取工藝提取的甾醇吸光度值高于正交表中9 次實驗的任一值。故可以確定此條件為最佳條件。

2.3 穩定性測定

精密吸取樣品溶液4 mL，分別顯色5，10，15，20，25，30 min 后，在445 nm 測定吸光度，結果RSD=1.24%，表明樣品溶液顯色后較穩定，在30 min內均可進行測定。

2.4 精密度的測定

準確吸取樣品溶液3. 00 mL 分別置于9 支20 mL 試管中，測定吸光度，結果平均吸光度為0.342，標準偏差S =0. 000 432 8，相對標準偏差RSD=0.126 5%，說明此方法的精密度高或重現性好。

2.5 回收率的測定

準確吸取樣品溶液3. 00 mL 分別置于6 只20 mL 試管中，其中 3 管中加入豆甾醇標樣3.00 mL，另3 管加入豆甾醇標樣4.00 mL，測定吸光度。結果樣品回收率為98.5% ～103.7%，平均回收率為101.6%，可以滿足分析測定的需要。

3 結論

(1)濕法皂化提取植物甾醇的優化工藝為:將10 g 青莢葉粉末溶于60 mL 氯仿中，50 ℃回流2 h，并減壓蒸干，重復2 次，殘渣加入10%的氫氧化鉀-乙醇飽和溶液在沸水浴中皂化反應90 min，用石油醚60 mL 萃取4 次，合并有機相，揮干溶劑。此時植物甾醇的提取率最高。

(2)利用甾醇類化合物與酸作用時，經脫水生成雙鍵而產生顏色物質的原理，采用磷硫鐵試劑作為顯色劑，與甾醇發生顯色反應，建立了青莢葉粉末中植物甾醇的分光光度測定方法。該法測定植物甾醇，有較好的穩定性、精密度和回收率，操作方法簡便，并且靈敏度較高，可用于植物甾醇的生產管理和產品質量的分析工作中。

［1］ 李雙妹.青莢葉多糖的提取及含量測定［J］.溫州職業技術學院學報，2010，10(2):49-52.

［2］ Kevin B Hicks，Robert A Moreau. Phytosterols and phytosterols:Fuctional food cholesterol busters［J］. Food Technology，2001，55(1):63-67.

［3］ 李英霞，王鳳云. 可見分光光度計測定大豆甾醇提取物中總甾醇的含量［J］.遼寧中醫藥大學學報，2007，9(5):154-155.

［4］ 阮棟梁，楊曉靜，李和. 沙棘葉中甾醇的分離與鑒定［J］.沙棘，2004，17(3):18-21.

［5］ 彭麗霞，朱億竹，魏陽吉，等. 葡萄籽油中植物甾醇的提取與鑒定［J］.中國食品學報，2012，12(3):185-191.［6］ 劉蕾，陳星，李曉麗，等. 分光光度計法測定大豆總甾醇含量的研究［J］.中國油脂，2005，30(4):45-47.

［7］ 李永輝，李海龍，譚銀豐，等. 番木瓜籽中總甾醇的含量測定［J］.海南醫學學報，2012，18(9):1223-1225.

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