山羊PID1 基因組織表達譜及其與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性

殷 捷， 凌英會， 丁建平， 王麗娟， 張運海， 章孝榮

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥230036;2.安徽省地方畜禽遺傳資源保護和生物育種重點實驗室，安徽 合肥230036)

磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1)是通過抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)篩選的肥胖與正常人腹膜后脂肪組織中差異表達基因［1］。Wang 等［2］發(fā)現(xiàn)在肥胖與健康者腹膜后脂肪組織中PID1基因差異表達，且在肥胖者脂肪組織中顯著上調(diào)。PID1基因在脂肪細胞生長中起著重要的作用［3］，已有學(xué)者提出將PID1基因作為一個抑制胰島素而導(dǎo)致肥胖的作用靶位點［4］。PID1基因在脂肪細胞中過表達可顯著促進3T3-L1 脂肪前體細胞的增殖，導(dǎo)致脂肪細胞數(shù)目增多，進而參與脂肪的發(fā)生發(fā)展［5］。反之，利用基因敲除手段下調(diào)PID1基因表達量后，脂肪細胞中胰島素敏感的葡萄糖大量攝取，促進IRS-1/PI3K/AKT信號通路，降低葡萄糖的濃度［6］。而且PID1基因參與了多組織胰島素的敏感調(diào)節(jié)，脂肪細胞胰島素敏感性的高低與脂肪沉積密切相關(guān)［7］。PID1基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新基因，作為一種信號分子在細胞生長和成脂過程中直接起作用，在脂肪組織中有PID1的高表達現(xiàn)象。錢源等將豬PID1基因作為重要生產(chǎn)性狀候選基因進行研究，通過肌內(nèi)脂肪(IMF)含量測定與基因表達關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)PID1基因與脂肪沉積性狀存在一定的關(guān)系［8］。

為了進一步驗證PID1基因?qū)?nèi)脂肪含量這一性狀的影響，篩選影響山羊生長性狀的候選基因，本研究采用Real time-PCR 技術(shù)對山羊PID1基因的組織表達特點以及PID1基因在安徽白山羊不同組織脂肪組織中的表達水平和肌內(nèi)脂肪含量進行關(guān)聯(lián)分析，從分子水平上揭示PID1基因與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采自合肥博大牧業(yè)種羊場。選擇0 月齡(6 只)、6 月齡(8 只)和12 月齡(9 只)的安徽白山羊，統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，飼喂等量日糧，自由飲水。禁食12 h 后頸靜脈放血屠宰。準(zhǔn)確稱量胴體質(zhì)量后立即取屠體的心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長肌和胸肌等10 個組織樣，標(biāo)記后放入液氮保存，后轉(zhuǎn)入實驗室-80 ℃冰箱保存，用于PID1基因表達分析。另采集腿肌、背最長肌和胸肌約30 g，置于-20 ℃保存，用于測定肌內(nèi)脂肪含量。

1.2 試劑和儀器

TIANpure Midi Plasmid Kit、Top10 感受態(tài)細胞、pMD18-T Simple Vector 為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;RNAiso Plus Total 、RNAPrimeScript RT reagent kit 為TaKaRa 公司產(chǎn)品;SYBR Premix 為羅氏公司產(chǎn)品;引物由華大基因公司合成;StepOnePlus實時熒光定量PCR 儀為美國ABI 公司;低溫高速離心機(Centrifuge 5417R)為德國Eppendorf 公司產(chǎn)品;PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-rad 公司產(chǎn)品。電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 肌內(nèi)脂肪(IMF)含量測定

取胸肌、腿肌和背最長肌，去除可見脂肪，粉碎后采用索氏抽提法分別測定胸肌、腿肌和背最長肌的肌內(nèi)脂肪含量。

1.4 PID1 基因表達分析

1.4.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 取約100 mg 樣品，用TaKaRa 公司的RNAiso Plus Total RNA 試劑提取安徽白山羊各組織的總RNA，將提取到的總RNA 分裝。取2 μl 粗提總RNA 在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測完整性，利用分光光度計SMA1000 測定其濃度和純度，檢測合格的RNA 于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA 按照TaKaRa 公司Prime-Script RT reagent kit 說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RT-PCR 反應(yīng)與克隆測序 以cDNA 第一鏈為模板進行PCR 擴增，分別對反應(yīng)條件、循環(huán)數(shù)等進行優(yōu)化。PID1和GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的PCR 反應(yīng)體系均為50.00 μl，其中10 ×Ex Tapbuffer 5.00 μl，Ex TapHS 0.25 μl，dNTP mixture 4.00 μl，上下游引物(20 μmol/L)各1.00 μl，cDNA 模板(50 ng)1.00 μl，ddH2O 34.75 μl。PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用天根50 bp Marker 作為標(biāo)記。純化的DNA 片段與PMD-18T simple 載體連接，并轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細胞，均勻涂布于固體培養(yǎng)基(33 g營養(yǎng)瓊脂加入1 000 ml 蒸餾水，以1 000∶ 1 的比例加入Amp+)表面，37 ℃培養(yǎng)16 ～18 h 獲得重組子，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，PCR 鑒定后送華大基因公司測序。

1.4.3 實時熒光定量PCR 及熔解曲線分析 用實時熒光定量儀檢測肌肉組織中PID1mRNA 表達水平。反應(yīng)體系15.0 μl，包括1.5 μl cDNA，0.9 μl 上下游混合引物，7.5 μl SYBR Green mixture，5.1 μl ddH2O。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s，60℃31 s，39 個循環(huán)。

1.5 安徽白山羊PID1 基因的組織表達特異性分析

以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為參照基因，SYBR GreenΙ 為熒光染料，采用RT-qPCR檢測安徽白山羊PID1基因在心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長肌和胸肌10 個組織中的相對表達量。以cDNA 為模板，用定量引物進行檢測，其反應(yīng)體系(15.0 μl)為:1.5 μl cDNA，0.9 μl上下游混合引物，7.5 μl SYBR Green mixture，5.1 μl ddH2O。于ABI StepOne RT-PCR 反應(yīng)儀上進行檢測，其反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s，60 ℃31 s，39 個循環(huán)，60 ℃捕捉熒光值。每個組織重復(fù)檢測4 次。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，其中ΔCt=CtPID1-CtGAPDH，ΔΔCt= ΔCt組織-ΔCt腿肌。

1.6 定量引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 中已公布的山羊的PID1基因(JN257257)序列，采用premier5.0 軟件設(shè)計目的基因上下游引物。以持家基因GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)GenBank 中山羊GAPDH基因(AJ431207.1)序列設(shè)計引物(表1)。所有引物均由華大基因公司合成。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of the target genes

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)熔解曲線來判斷PCR 反應(yīng)的特異性，根據(jù)熒光定量PCR 的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線中的擴增效率計算定量試驗結(jié)果。所得結(jié)果采用MX3000p 定量軟件進行分析。相對定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各部分肌肉內(nèi)脂肪含量的比較

選取0 月齡組、6 月齡組和12 月齡組3 個生長階段個體，屠宰后分別測定背最長肌、腿肌和胸肌的肌內(nèi)脂肪(IMF)含量。隨著月齡的增加，山羊各部分肌肉肌內(nèi)脂肪含量的發(fā)育性變化模式基本一致，呈上升趨勢，且0 ～12 月齡背最長肌IMF 含量均顯著高于腿肌和胸肌(表2)。

2.2 PID1 基因的時空表達譜分析

通過測序和Blast 比對發(fā)現(xiàn)，PID1和GAPDH基因的TR-PCR 擴增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期一致，同源性在99%以上，其中GAPDH基因同源性為100%。利用實時定量PCR 對心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長肌和胸肌10 個組織中PID1基因的表達情況進行檢測，檢測結(jié)果見圖1。PID1基因在所有組織中均表達，其中在0 月齡肺、6 月齡小腸和脂肪、12 月齡脂肪組織中高度表達，在0 月齡肝、6 月齡肝、脾和肺及12 月齡的脾和肺部組織中度表達，在其余組織中相對低度表達。

表2 3 個組織的肌內(nèi)脂肪含量比較Table 2 The comparison of IMF content among three tissues

圖1 PID1 基因的相對表達譜Fig.1 The relative expression level of PID1 gene

由圖2 可見，隨著年齡的增加，肝臟中PID1表達量呈顯著直線下降趨勢(P＜0.05)，脾中PID1表達量逐漸上升，心PID1表達量先上升后下降，肺中PID1表達量先下降后上升;PID1在腎中一直為低表達，12 月齡時有稍微上升的趨勢;腿肌、背最長肌和胸肌中的PID1基因表達量均呈上升的趨勢。

圖2 各組織PID1 基因表達量的發(fā)育性變化Fig.2 The developmental changes of the expression level of PID1 in tissues

圖3 脂肪組織中PID1 表達量的發(fā)育性變化Fig.3 The developmental changes of the expression level of PID1 in the adipose

2.3 脂肪組織中PID1 基因表達水平分析

利用實時熒光定量技術(shù)對各月齡組山羊PID1基因表達水平進行檢測，結(jié)果(圖3)顯示各月齡組間脂肪組織PID1基因表達水平均差異顯著(P＜0.05)。

2.4 PID1 基因表達水平與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性

對山羊脂肪組織PID1基因mRNA 表達量及肌內(nèi)脂肪含量進行簡單線性相關(guān)分析，結(jié)果表明0 ～12 月齡期間PID1基因mRNA 表達量與背最長肌IMF 含量呈顯著相關(guān)(r= 0.968，P＜0.05)，而PID1表達量與腿肌(r= 0.910)和胸肌(r= 0.879)IMF 含量間沒有顯著相關(guān)(P＞0.05)。

3 討論

大量遺傳學(xué)、藥理學(xué)和生理學(xué)試驗結(jié)果表明，PID1在細胞生長和成脂過程中起直接調(diào)節(jié)作用，對于嚙齒類動物的研究也證實了這一點［9］。PID1基因有一個PTB(磷酸酪氨酸作用位點)結(jié)構(gòu)域，與信號蛋白shc 上PTB 結(jié)構(gòu)域相似，參與生長因子刺激下細胞增殖等下游效應(yīng)［10］。PTB 結(jié)構(gòu)域可參與低密度脂蛋白受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在哺乳動物中首先作為一種失效(Dab-1)蛋白使小鼠mdabl基因自發(fā)常染色體隱形突變［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)PID1基因在3T3-L1 脂肪細胞中過表達能夠顯著下調(diào)脂肪細胞胰島素信號途徑中胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的基因-葡萄糖轉(zhuǎn)運子4(GLUT4)的表達［12］，明顯促進3T3-L1 前體脂肪細胞增殖，不影響脂肪細胞的分化過程［13］。同時張春梅［14］等的研究結(jié)果也證明，PID1基因過表達能抑制胰島素刺激直接影響脂肪細胞對葡萄糖攝取，并抑制葡糖的轉(zhuǎn)換，進而影響機體的胰島素敏感性，導(dǎo)致脂肪組織的沉積。有研究結(jié)果表明，參與能量代謝的基因可能會影響家畜的重要經(jīng)濟性狀［15］。這一結(jié)論在陳哲等［16］、王興平［17］等的試驗結(jié)果中得到印證。Xu 等［18］從天府山羊中克隆出PID1基因，獲得一段896 bp 的cDNA序列，PID1基因在天府山羊背最長肌中的表達隨著年齡的增長而顯著增加。

本研究發(fā)現(xiàn)PID1基因在不同組織(如肺、小腸、脂肪組織、肝、脾)呈中度、高度表達，這與對豬的研究結(jié)果相符［19］。肝臟中PID1基因表達顯著降低(P＜0.05)，而脂肪組織中PID1表達呈顯著增長趨勢(P＜0.05)，這一結(jié)果可能與肝臟是機體脂肪代謝的重要器官相關(guān)［20］。如果能利用RNAi 等技術(shù)進一步降低組織中PID1基因表達水平，或許能直接觀察到PID1的表型效應(yīng)。PID1基因在不同個體脂肪組織中表達水平的檢測結(jié)果表明，隨著肌內(nèi)脂肪含量的增加，PID1的表達水平呈遞增趨勢，且各月齡組之間表達量差異顯著(P＜0.05)，這與其在成脂過程中的調(diào)節(jié)功能是相一致的。進一步的相關(guān)分析結(jié)果表明，0 ～12 月齡期間PID1基因的表達量與背最長肌肌內(nèi)脂肪含量呈顯著相關(guān)(r=0.968，P＜0.05)，與Xu 等［18］的結(jié)論一致;PID1基因表達量與0 ～12 月齡腿肌肌內(nèi)脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)r=0.910，但未達到顯著水平;PID1基因表達量與0 ～12月齡胸肌肌內(nèi)脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)r=0.879，也未達到顯著水平。以上結(jié)論說明PID1基因的表達量與山羊脂肪沉積有關(guān)聯(lián)。PID1的表達對腿肌和胸肌IMF 沒有影響，但不足以說明其只對山羊背最長肌有影響，因為腿肌和胸肌中IMF 含量差異不顯著，這需要擴大群體數(shù)量重新選擇樣本進行研究。

本研究利用實時定量PCR 技術(shù)對PID1基因在山羊不同體組織中的表達情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)其在心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長肌和胸肌中均有不同程度的表達。進一步研究PID1基因在不同個體脂肪組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)PID1基因的表達量均與背最長肌、腿肌和胸肌IMF 相關(guān)。進一步證明了PID1基因可以作為影響山羊育肥性狀的重要分子遺傳標(biāo)記進行研究，為優(yōu)質(zhì)肉羊的選育提供了理論依據(jù)。

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