“勿忘我”叢生芽誘導及植株再生

王淑敏，高永闖，李曉云 (廊坊師院生命科學學院，河北廊坊065000)

勿忘我(Limonium sinuatum(L).Mill)屬藍雪科(Plumbaginaceae)補血草屬(Limonium)多年生或二年生草本植物，原產地中海沿岸地區，株高可達1.1 m，花色繁多，具有天然干花的特性，花瓣含水量低，富有蠟質，在植株體上呈現出干燥的蠟質或紙質的特色，可以長期保持美麗的花色和花型，是目前天然干花類中作切花批量生產的花之一［1］，也可在野生園林中作露地栽培，或剪下作小插花中主花的配花［2］。藥理研究表明，勿忘我花茶含有豐富的維生素C，可延緩細胞衰老，提高機體免疫能力，抗病毒，抗癌防癌并能美白肌膚，具有護膚養顏、補腎提神、健胃開胃、調節血脂減肥、促進新陳代謝等功能［3］。

補血草屬植物具有大量的不孕枝和同型雜交不孕的特性，種子結實少，若用種子繁殖，種子來源的可靠性限制了批量生產［2］。因此研究勿忘我叢生芽誘導及植株再生具有一定的實踐意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

1.1.1 試驗材料。選取飽滿無蟲害的勿忘我種子。

1.1.2 消毒方法。將勿忘我種子，用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇消毒30～40 s，無菌水沖洗5次，分別用0.1%升汞、2%次氯酸鈉消毒處理，具體為:①0.1%升汞5 min;②0.1%升汞7 min;③0.1%升汞9 min;④2%次氯酸鈉8 min;⑤2%次氯酸鈉13 min;⑥2%次氯酸鈉18 min。

每次處理完用無菌水沖洗8～10次，每次1 min。然后將無菌種子種植在放有濾紙的無菌瓶和MS固體培養基中，置恒溫培養室中23℃培養，待發育成無菌苗。15 d后統計發芽率、污染率。

發芽率=(發芽種子數/接種種子數)×100%污染率=(污染種子數/接種種子數)×100%

1.2 培養基

1.2.1 叢生芽誘導培養基。A1:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A2:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A3:MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

1.2.2 生根培養基。B0:1/2 MS;B1:1/2 MS+IBA 0.2 mg/L;B2:1/2 MS+IBA 0.4 mg/L;B3:1/2 MS+IBA 0.6 mg/L。

1.3 叢生芽誘導 分別取勿忘我的下胚軸(長0.5 cm)、莖尖(長1 cm)、子葉(0.5 cm ×0.5 cm)作為外植體，3 種外植體均接種到A1、A2、A3培養基上，在各培養基上接種30個，接種后在24℃下培養進行叢生芽誘導［4－6］。

1.4 生根與植株再生 剪取健壯的單芽(長1.5～2.0 cm)，分別接種到B0、B1、B2、B3培養基上進行生根。

2 結果與分析

2.1 種子消毒結果 不同材料所用消毒液不同，消毒效果也不同。對于勿忘我種子而言，消毒效果最好的是升汞，但處理時間過長易把種子殺死。首先取空白對照組，不加處理的勿忘我種子的發芽率為69%，污染率為71%。由表1可知，0.1%的升汞和2%的次氯酸鈉對勿忘我種子的消毒效果都很好，沒有污染，并在特定的消毒時間段內，對種子的活性影響也較小。由此可知，使用次氯酸鈉對忽忘我種子消毒更適宜，尤以消毒8 min為宜，處理后對種子萌發率影響不大。勿忘我種子在接種15 d后即可長成綠色健壯的無菌苗。

表1 不同消毒時間的滅菌效果

2.2 不同外植體對不定芽形成的影響 以莖尖為外植體，在基部膨大形成球狀愈傷組織，隨后產生大量叢生芽，速度最快的接種20 d后即有芽點形成;以莖段為外植體，莖段整體膨大，未產生叢生芽;以子葉為外植體，未形成芽。不同外植體對不定芽誘導效果影響很大，出芽情況以莖尖出芽率最高，而莖段和子葉則不能誘導出叢生芽。

2.3 不同濃度的6-BA對莖尖叢生芽誘導的影響 接種后莖尖在下端邊緣開始膨大增厚，繼而周圍出現淺綠色顆粒狀突起，約25 d后，這些突起繼續生長成淡綠色小芽。由表2可知，莖尖叢生芽發生數量隨6-BA濃度的升高而增多。從生長狀態來看，A3培養基所誘導的芽雖然在所有培養基中的芽數最多，但其芽的質量較其他培養基而言不高(圖2)，表明雖然6-BA打破了其頂端優勢，但其各個叢生芽的生長點不突出，芽的健壯程度也較低。綜合來看，A2培養基上的芽生長最好，出芽率適中，芽也健壯(圖1)。故在莖尖叢生芽的誘導中，6-BA的濃度以1.0 mg/L為宜。

表2 不同濃度6-BA對勿忘我莖尖叢生芽誘導的影響

2.4 不同濃度的6-BA對子葉叢生芽誘導的影響 子葉作為外植體接種到培養基上后無變化，隨著時間的推移子葉出現不同程度的褐化。在A1、A2和A3培養基中，子葉均沒有誘導出叢生芽，最后褐化干枯死亡。

2.5 不同濃度的6-BA對莖段叢生芽誘導的影響 莖段作為外植體在叢生芽誘導過程中，膨大，但沒有產生愈傷組織，隨著時間的推移膨大的莖段褐化而死，最終沒有叢生芽的誘導;這可能是因為產生了大量次級代謝物，這些次級代謝物最后導致莖段死亡，沒有誘導出叢生芽。莖段叢生芽的誘導率也為0。

2.6 誘導芽苗生根效果 生根誘導以1/2MS為基本培養基，附加IBA，設計4個濃度水平。將繼代培養后高度達1.5～2.0 cm，生長健壯的芽苗進行生根誘導。無根苗在生根培養基中，約9 d后分化形成根。

表4 不同濃度IBA對生根的影響

3 討論

3.1 外植體消毒 從外界取得的外植體進行接種時，常含有較多的雜菌，對其消毒時間太短不易除去，時間太長又會對外植體造成較大的傷害。該試驗選取種子進行消毒較容易，基本解決了上述問題，污染率降低，適合選用。在試驗中采用2種方式進行消毒，最終結果都很好，沒有出現污染，而且在種子萌發率上差別也不大。綜合簡單易行的原則和環境友好性原則，推薦使用次氯酸鈉作為消毒劑，處理時間以8 min為宜。

圖1 誘導培養基A2中產生的叢生芽

圖2 誘導培養基A3中產生的叢生芽

圖3 在誘導生根培養基B1中產生的根

3.2 外植體選擇 該試驗選取莖尖、莖段(不帶腋芽)、子葉作外植體，通過誘導，3種外植體都可誘導出愈傷。但莖段和子葉不能誘導出叢生芽，莖段膨大出現愈傷后再培養則會褐化死亡。莖尖作為外植體誘導速度最快，芽苗健壯，增殖率高，是勿忘我進行離體快速繁殖的最佳外植體。

3.3 最佳叢生芽誘導培養基 馮曉英在對6-芐氨基嘌呤(6-BA)、激動素(KT)和苯基噻二唑脲(TDZ)在勿忘我芽增殖上的效果進行了比較。苯基噻二唑脲(TDZ)是一種具有高度細胞分裂素活性的棉花脫葉劑，當TDZ濃度為0.01 mg/L時，勿忘我離體培養芽增殖的能力相當于6-BA 0.4 mg/L時的增殖能力。當TDZ濃度為0.04和0.06 mg/L時，芽的增殖效果與不加任何試劑差異不大。

3.4 最佳生根培養基 觀察發現，NAA誘導生根，根基部愈傷組織較少，根粗壯，數量多，且有一定的長度;IBA則根少細長。結果表明，試管苗生根以0.4 mg/L NAA效果較好，其次是0.6 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA。在植物試管苗微型繁殖誘導生根階段，由于培養環境的高溫、高濕和弱光等因素的影響，常使得芽苗徒長和根系纖弱，導致再生小植株的抗逆性差和移栽成活率低。這表明，低濃度的PP333對根的生長有促進作用，生根率與對照組只加0.4 mg/L NAA差異不大，但可以使根加粗，而高濃度時所需根長時間明顯縮短，生根率降低，根特粗。從苗長勢來看，以在生根培養基中附加0.02%PP333的長勢為好。

［1］金波.鮮切花栽培技術手冊［M］.北京:中國農業大學出版社，1998:50－65.

［2］周昆華，易栽培.久不凋的花卉勿忘我［J］.云南農業科技，1993(6):36.

［3］高麗霞，邢柏芝.補血草組織培養試驗［J］.北方園藝，1999(2):5.

［4］陳佳瀛，杜秀達.補血草的組織培養和快速繁殖［J］.植物生理學通訊，2002，12(6):594.

［5］王秀麗，楊煜，徐平麗，等.植物組織培養的應用及進展［J］.山東農業科學，2005(3):78－80.

［6］王文靜，袁道強，高松潔.植物組織培養的應用現狀［J］.河南師范大學學報，2000(3):137－139.