野韭菜花器官脫分化影響因子研究

王 茜，龍驪豐，韋鵬霄，岑秀芬，萬正林，3，龍明華*

(1.廣西大學農學院，廣西南寧530004;2.廣西大學行健文理學院理工學部，廣西南寧530005;3.廣西現代農業科技示范園，廣西南寧530007)

野韭菜(Allium hookeri Thwaites)為百合科蔥屬多年生草本植物，原稱為寬葉韭，又稱為大葉韭、觀音菜、巖蔥等，我國各地均有分布［1］。野韭菜和普通韭菜很相似，多以其嫩葉和成長葉食用。其葉片較寬，纖維含量稍多，具有蔥香味，富含碳水化合物、維生素C及硫、鐵、磷等礦物質元素，尤其含豐富的胡蘿卜素和纖維素，還含有辛香的揮發性物質——硫化丙烯，有增進食欲和殺菌的作用［2］。此外，野韭菜還有溫中行氣、散血解毒、健胃整腸等功效［1］。由于野韭菜的保健功能和人們崇尚回歸自然的消費理念，目前市場上對包括野韭菜在內的野生蔬菜的需求與日俱增，供不應求。但野韭菜只開花而不能結籽，其繁殖方式以分株繁殖為主，繁殖周期長，繁殖率低，極大影響了野韭菜的大面積推廣種植，因此研究野韭菜的組培快繁技術顯得尤為重要。目前有關野韭菜的組織培養方面的研究較少，筆者研究了影響野韭菜花器官脫分化的誘導因子，旨在為建立野韭菜組織培養快繁體系奠定技術基礎，也為野韭菜種質資源的保存和開發利用探索生物技術上的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 以采自廣西金秀縣圣堂山上的野韭菜花器官(花莖、花盤、花柄、花蕾)為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制。以 MS、Miller、White培養基為基本培養基，并添加不同的植物生長調節劑，附加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，pH 調至5.8。

1.2.2 外植體滅菌。于晴天上午采取健壯且無病蟲害的花器官。按照花苞開放狀態(未開、半開、全開)，將花器官材料分為3組。分別將3組材料置于洗潔精溶液中，用軟毛刷輕刷表面塵埃后用清水沖洗30 min;在超凈工作臺上將洗凈的材料置于無菌燒杯中，用75%乙醇精漂洗30 s;再用0.1%升汞浸泡滅菌10 min，并不斷晃動;滅菌完畢用無菌水清洗5次，備用。

1.2.3 外植體接種。將滅過菌的花蕾、花柄、花盤、距花盤5 cm內的花莖等外植體分別接入添加不同激素的誘導培養基中。每組處理接30瓶，每瓶接種3個外植體，設3次重復。

1.2.4 培養條件。將接種好的試驗材料置于培養室中培養，培養溫度為(25±2)℃，暗培養15 d后轉入光下培養，光照強度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d。

1.3 數據分析 接種后定期觀察各種外植體、各試驗處理的愈傷組織發生情況，觀察愈傷組織的質量、出愈時間并統計岀愈率。運用電子表格軟件(Excel2003)、方差分析軟件(SPSS18.0)對數據進行整理及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 培養基種類對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導的影響 由于不同基本培養基所含的礦物質種類和配比差異較大，因此對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導的效果也存在差異。從表1可以看出，在MS、Miller、White 3種基本培養基中加入相同的激素組合，MS培養基對花苞未開花蕾的愈傷組織誘導率最高，愈傷組織的質量也最好。這可能是由于MS基本培養基的礦物質種類及比例較適合野韭菜花蕾愈傷組織的發生。花蕾的愈傷組織誘導率由高到低的基本培養基順序為MS＞Miller＞White。各個處理的差異均達極顯著水平。這表明選擇合適的基本培養基可以提高愈傷組織的誘導率，MS基本培養基最適合野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織的誘導。

表1 培養基種類對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導的影響

2.2 不同種類生長素與6-BA組合對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導的影響 生長素是植物組織培養中不可缺少的物質之一，不同生長素對植物愈傷組織的形成影響不同。從表2可以看出，在相同濃度的NAA、IAA、IBA、2，4-D與同一濃度的6-BA組合處理中，以NAA與6-BA組合的處理對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導率最高，其次是2，4-D，再次是IBA，最低是IAA，4種生長素處理之間的差異達極顯著水平。這表明選擇合適的生長素可以提高花苞未開花蕾愈傷組織的誘導率，在4種生長素中NAA最適合野韭菜花苞未開花蕾愈組的誘導。

表2 不同種類生長素與6-BA組合對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導的影響

2.3 不同濃度NAA與6-BA組合對野韭菜不同發育時期花蕾愈傷組織誘導的影響 不同濃度的NAA與6-BA組合對野韭菜不同發育時期花蕾愈傷組織的誘導影響不同。從表3可以看出，在相同的花苞開放狀態下，當NAA的濃度在0～1.5 mg/L時，對野韭菜花蕾的愈傷組織誘導率呈低高低的趨勢。其中濃度在1.0 mg/L時最高。各處理之間差異達極顯著水平。在相同的培養基及激素處理中，花苞不同開放狀態下的花蕾岀愈率由高到低為未開狀態＞半開狀態＞全開狀態。這表明1.0 mg/L 6-BA與1.0 mg/L NAA組合較適合野韭菜花蕾愈傷組織的誘導，而選擇花苞未開的花蕾作為外植體可以提高愈傷組織的誘導率。

表3 不同濃度NAA與6-BA組合對野韭菜不同發育時期花蕾愈傷組織誘導的影響

2.4 不同激素組合對野韭菜花苞未開花器官不同部位愈傷組織誘導的影響 以MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L培養基為對照并分別添加0.5 mg/L 2，4-D、KT和CPPU對花苞未開放狀態下的花器官不同部位的愈傷組織誘導進行對比。結果表明，同一激素組合對花蕾、花柄、花盤和花莖的愈傷組織誘導效果不同。按愈傷組織誘導率高低排序為花盤＞花蕾＞花柄＞花莖;按激素誘導愈傷組織的生理功效排序為2，4-D＞CPPU＞KT。3種激素處理愈傷組織誘導率的差異均達到極顯著水平。這表明花器官不同部位的愈傷組織誘導效果存在明顯的部位效應，花盤的愈傷組織誘導率達100%，其次是花蕾，最差的是花柄，而花莖無愈傷組織發生。

表4 不同激素組合對野韭菜花苞未開花器官不同部位愈傷組織誘導的影響

3 討論

3.1 基本培養基的影響 器官發生是生物學中的基本問題之一，受到各種內外因子的影響及調控。培養基能為植物的生長提供營養，是組織培養過程中必不可少的物質基礎。不同植物的遺傳特性、生物學特性、生態學特性不同，這使得植物對各種營養元素的吸收量不同，最適培養基的成分也存在差異。饒月輝等［4］通過試驗比較了 MS、WH、LS、N6和 SH 5種培養基對韭菜栽培品種莖尖培養的影響，結果表明，MS是韭菜栽培品種莖尖組織培養最適基本培養基。李勇等［5］、王明耀等［6］、王桂英［7］分別通過花托、花器官、根尖在 MS培養基上添加不同的激素成功地誘導出韭菜栽培品種的愈傷組織，只是未做不同培養基的對比試驗。結果表明，在MS、Miller、White 3種培養基中，MS培養基對野韭菜花蕾愈傷組織誘導的效果最好。原因可能是MS培養基屬于富集元素平衡培養基，大量元素和微量元素的含量齊全且豐富，具有較好的誘導性能;而Miller和White分別是中等無機鹽培養基和低無機鹽培養基［8－9］，它們的組成或含量并未達到誘導野韭菜花蕾出愈的最佳要求。

3.2 植物生長調節劑的影響 在組織培養過程中添加一定種類和濃度的生長調節劑是植物脫分化和再分化的重要手段［10］。植物生長內源調節物質對植物組織和細胞的增殖、分化起著關鍵作用;培養基中的外源植物調節劑主要是通過對細胞的基因表達與活性調控影響細胞的脫分化，其適宜的種類和配比水平，反映了植物組織和器官的內源激素水平的差異與其在脫分化過程中對這些物質的要求［11－12］。植物生長調節劑在一定的范圍內能促進生長，但過高或過低都會影響其生長［13］。該試驗結果表明，在 NAA 0～1.5 mg/L時，當濃度為1.0 mg/L時愈組誘導率最高，為NAA的最佳濃度。王明耀等［6］通過試驗證明花器官的岀愈率主要與生長素和細胞分裂素的種類和配比有關，在其處理中添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L 2組激素組合的 MS培養基對韭菜栽培品種花蕾愈傷組織誘導效果明顯，與該研究較一致。該研究進一步進行了生長素種類及濃度的篩選試驗，使試驗進一步細化，發現在愈傷組織誘導階段，2，4-D的效果優于CPPU，更優于KT。

3.3 植物生理狀態的影響 已分化的植物細胞具有全能性。一般而言，細胞全能性的高低與細胞的分化程度有關，分化程度越高，細胞全能性越低，全能性的表達就越困難。對于野韭菜而言，花器官是其生長發育最旺盛的部位之一。在形態發生的研究中，將外源激素與物種的遺傳性及器官和組織的生理狀態聯系起來的工作很有限，且外源激素對器官發生的作用機理也不十分清楚［14］。因此建立一個較好的試驗材料體系是必須且重要的。

該研究證明野韭菜花苞開放狀態是影響花器官岀愈率的主要影響因子。花苞未開花器官是培養野韭菜植株再生的優良外植體，其中花盤岀愈率最高，為100%?；ㄇo在所研究的花苞各種開放狀態下及各種激素組合下無分化能力，不推薦其作為野韭菜快繁的外植體材料。說明植物的遺傳性及生理狀態在形態發生過程中所起的作用可能比激素本身更加關鍵。此結論與王明耀［6］、郝建平等［15］的試驗結果一致。因此，通過脫分化途徑來進行野韭菜組培快繁時，應注意在外植體材料本身的遺傳性及生理狀態方面進行篩選。

4 結論

綜上所述，MS培養基最適合野韭菜花蕾愈傷組織誘導;2種激素組合中以6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L對花苞未開花蕾愈組誘導效果最好;3種激素組合中以2，4-D、6-BA與NAA的組合對野韭菜花器官愈傷組織誘導效果最好;岀愈率高低按照花器官部位排序為花盤＞花蕾＞花柄＞花莖;岀愈率高低按照花器官發育時期即花苞開放狀態排序為未開狀態＞半開狀態＞全開狀態。

對野韭菜花器官脫分化得到的愈傷組織進行繼代增殖，再分化獲取完整植株等后續試驗研究正在進行之中。

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