不同基因型亞麻花粉小孢子離體培養研究

宋淑敏，夏尊民，王曉楠 (黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163319)

亞麻是重要的纖維及油料作物，亞麻纖維具有吸汗、透氣性良好和對人體無害等顯著特點，越來越受到人類重視。亞麻油含多量不飽和脂肪酸，故用來預防高血脂癥和動脈粥樣硬化等疾病。因此亞麻具有廣闊的發展和應用前景。

我國亞麻花藥培養研究始于20世紀70年代，并由我國首次從亞麻花藥培養中獲得花粉植株，但亞麻花藥愈傷組織的誘導率和綠苗分化率很低，且存在大量的從花藥壁等組織發育而來的二倍體植株，給單倍體鑒定帶來很大困難，嚴重制約了亞麻單倍體育種進程。

在花藥培養基礎上開展的游離花粉小孢子培養技術近年來已有長足的進步。游離花粉小孢子培養是把小孢子從花藥中分離出來，進行人工培養?；ǚ坌℃咦优囵B具有其獨特的優越性。首先，游離花粉是單倍性細胞，游離花粉的培養可減少倍性鑒定的工作量，提高了生產單倍體的效率。其次，它可作為高效的細胞篩選系統，使農藝性狀迅速穩定，避免后代的分離。再次，它可作為轉基因的受體材料，通過染色體加倍，使外源基因快速純和。20世紀70年代初，NITSCH等首先報道了煙草的游離小孢子培養。KYO等建立了煙草的游離小孢子高效產生單倍體植株的方法。研究者首次從甘藍型油菜花藥中分離出小孢子并誘導獲得小孢子胚和再生植株［1］。研究表明，經預培養，直接培養大麥離體花粉粒，獲得了再生植株［2］。但目前關于亞麻游離花粉小孢子培養的研究在國內尚未見報道。筆者通過研究不同基因型亞麻花粉小孢子愈傷組織誘導及分化的差異，篩選出花粉培養的理想材料;篩選出適宜亞麻花粉小孢子培養的培養基，建立亞麻花粉小孢子離體培養再生體系，以期加快亞麻單倍體育種進程，并為細胞水平的突變體篩選、轉基因研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 在黑龍江省科學院大慶分院試驗田于6月中下旬采集5種不同基因型的亞麻雜交后代(F1)花粉處于單核中后期的花蕾，材料代號為 9601、9605、9712、9715、9718。將花蕾用濕紗布包裹，放入4℃左右的冰箱中保存備用。

1.2 培養基 以自行研制的亞麻花培專用培養基HA為基本培養基，愈傷組織誘導培養基為HF1:HA+1.5 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L6-BA+脯氨酸300 mg/L+蔗糖30 g/L+7 g/L瓊脂粉，pH 5.5;亞麻游離花粉愈傷組織分化培養基為HF2:HA+1.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L 瓊脂粉，pH5.5;亞麻花粉植株生根培養基為HF3:HA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L 瓊脂粉，pH 5.5。

1.3 方法。

1.3.1 外植體表面消毒。將亞麻花蕾放入3%的次氯酸鈉溶液中消毒15 min，再用無菌水沖洗3次，取出花藥放入盛有無菌水的培養皿中，用針刺釋放法將花粉粒釋放到無菌水中，再通過過濾離心收集花粉，制成花粉懸浮液，花粉密度為0.5 ×102個/ml。

1.3.2 愈傷組織的誘導。將花粉懸浮液接入誘導培養基，放在20～25℃暗培養10 d，再放在20～25℃、1 000 lx條件下培養15 d，統計愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率=愈傷組織塊數/接種的花粉數×100%。

1.3.3 愈傷組織的分化培養。當愈傷組織長至5 mm左右時，將其轉到分化培養基上。培養溫度為25℃，光照時間為12 h/d，光強為2 000 lx。20 d后統計愈傷組織的分化率。愈傷組織的分化率=分化綠苗的愈傷組織塊數/轉入分化培養的愈傷組織數×100%。

1.3.4 生根培養及移栽。當幼苗長至3～5 cm時轉至生根培養基中，培養條件同“1.3.3”。20 d后統計生根率。當根長為2 cm時，打開瓶膜煉苗3 d，用鑷子將幼苗從培養基中取出，再用清水洗去根部的培養基，然后栽入花盆中，覆蓋塑料膜保濕，5 d后揭去膜。

2 結果與分析

2.1 不同基因型對亞麻花粉愈傷組織誘導的影響 以不同基因型亞麻的花粉小孢子為外植體，共接種5個雜交組合的亞麻花粉懸浮液。每個組合取2 ml花粉懸浮液(花粉密度為5.0×102個/ml)接種至HF1培養基上，進行花粉愈傷組織的誘導，在20～25℃、光照強度2 000 lx、光照時間8 h下培養25 d，統計花粉愈傷組織的誘導率。10 d左右花粉愈傷組織陸續出現，結果表明，不同組合亞麻花粉愈傷組織的誘導率差異顯著，其中9601、9605組合花粉愈傷組織的誘導率最高，花粉愈傷組織的誘導率分別為30.8%、28.6%。9715的愈傷組織的誘導率相對較低(20.6%)(圖1)。

圖1 不同基因型亞麻花粉愈傷組織的誘導率

2.2 不同培養基對花粉愈傷組織誘導的影響 取同一雜交組合(9601)的花粉接種至 MS、B5、N6、HF1培養基上，每種培養基均接種4 ml花粉懸浮液(花粉密度為5.0×102個/ml)，4 種培養基中激素配比均為 1.5 mg/L 2.4-D，0.5 mg/L 6-BA。在20～25℃、光照強度為2 000 lx、光照時間8 h下培養15 ～30 d。結果表明，HF1、MS、B5、N64 種培養基花粉愈傷組織的誘導率分別為 29.7%、6.2%、8.6%、18.5%，以 HF1培養基花粉愈傷組織誘導率最高，其次是N6培養基(圖2)。

2.3 不同基因型對亞麻花粉愈傷組織分化的影響 當花粉愈傷組織長至3～5 mm，轉入亞麻花粉愈傷組織分化培養基HF2中，誘導花粉綠苗的分化，研究5種不同基因型的亞麻花粉愈傷組織在培養基HF2中花粉綠苗的分化情況。在18～25℃、光照強度為2 000 lx、光照時間12 h下培養20～30 d，統計花粉綠苗的分化率。結果表明，不同組合之間的花粉綠苗分化頻率差異顯著，以9601組合的花粉綠苗分化頻率最高(14.5%)。其次為9718和9712，分化率分別為11.5%和8.0%(表1)。

圖2 不同培養基花粉愈傷組織的誘導率

表1 不同雜交組合的愈傷組織在HF2培養基中花粉綠苗分化率

2.4 壯苗及生根 當分化芽長至1～2 cm時，應及時切取并轉至壯苗培養基(HA+0.5 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA)中培養，當花粉綠苗長至5 cm左右時，將其轉至HF3生根培養基中，在20～25℃、光照強度1 000 lx、光照時間8 h下培養，亞麻花粉綠苗的生根率達95.2%以上。

3 小結與討論

(1)亞麻不同基因型影響其再生能力。不同基因型亞麻花粉愈傷組織的誘導率和綠苗再生頻率差異較大。該研究共用了5種基因型的亞麻進行花粉培養，其中9601組合的花粉愈傷組織的誘導率、花粉綠苗再生頻率最高，9601可作為亞麻花粉培養的理想供試材料。

(2)誘導培養基中加入2，4-D對誘導花粉愈傷組織十分必要，但2，4-D的用量超過2 mg/L時，獲得愈傷組織的綠苗分化能力降低。

(3)培養溫度是影響亞麻花粉愈傷組織質量的主要因素，誘導愈傷組織階段培養溫度不宜超過30℃。培養溫度超過30℃，易產生松脆、水漬狀的愈傷組織，這種愈傷組織極不宜分化，即使分化，分化出的玻璃苗較多。

(4)該研究初步建立了亞麻花粉小孢子培養再生體系?；ǚ坌℃咦优囵B體系的建立為在細胞水平上進一步進行亞麻單倍體育種奠定了基礎。今后還要對亞麻花粉小孢子培養體系進行不斷完善，使亞麻花粉小孢子培養在細胞突變體篩選、轉基因等領域得到更廣泛的應用。

［1］肖尊安.植物生物技術［M］.北京:化學工業出版社，2005:106－107.

［2］顏昌敬.農作物組織培養［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1991:255－256.