轉基因技術在玉米育種中的運用

王良發，張守林，盧瑞乾，李長建，李風章，王 靜，張素芬 (河南省鶴壁市農業科學院玉米研究中心，河南鶴壁458030)

玉米是人類重要食物之一，在過去的幾十年里，傳統雜交育種為人類糧食生產作出了巨大貢獻。但隨著人口數量的劇增，傳統育種技術已不能滿足人類對食物、能源等的需求。轉基因技術因能在較短時間內生產人們所需的生物性狀而迅速發展。據專家預測，到2030年，全球50%的農產品將由轉基因技術提供［1］。筆者就玉米轉基因在抗除草劑、抗蟲、抗病、抗鹽堿等方面的成果進行了回顧，以期為我國玉米分子育種研究提供參考。

1 技術回顧

1.1 玉米轉基因技術 將外源 DNA片段轉入玉米細胞中主要有3種方法:①載體介導轉化法，如農桿菌介導法;②DNA直接導入法，如基因槍法;③種質系統轉化法，如花粉管通道法。

1983年，農桿菌轉化法成功運用于雙子葉植物煙草，直到1996年，ISHIDA等［2］構建超雙元載體，以根癌農桿菌為媒介轉化玉米自交系A188的幼胚，獲得了轉基因植株，農桿菌轉化法得以在玉米育種中廣泛運用。

基因槍法是將外源DNA包裹在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓放電所產生的推力下高速微粒射入受體細胞或組織，使之導入細胞。基因槍法具有不受受體類型限制，可同時轉化多個基因，轉化率高的特點。

1988年，周光宇等［3］提出并發展了花粉管通道法，該法的主要原理是授粉后使外源基因能沿花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。該法操作簡單，無需建立愈傷組織誘導，省時省力，不受植株基因型限制。

1.2 標記基因 作物轉基因所應用的轉化系統只能使一小部分細胞穩定轉化，因此在導入目的基因的同時還要導入標記基因，賦予轉化體特定標記以便于識別和鑒定［4］。部分常用于轉基因玉米的標記基因見表1。

表1 常用于轉基因玉米中的標記基因

2 轉基因技術在玉米中的應用

2.1 抗除草劑 將抗除草劑耐性引入玉米是增加對除草劑選擇及安全性的一種新途徑，也是一種高效、低成本、無公害的控制雜草的手段。

1996年美國孟山都公司最先注冊了抗草甘膦(農達)的玉米品種，1997年美國孟山都公司已將EPSPS轉基因玉米應用于大田試驗。SR玉米是BASF公司開發的抗除草劑玉米，對除草劑具有高度耐受性，在出芽后噴施可防治大多數禾本科雜草。在抗除草劑基因中以來源于吸水鏈霉菌的(Streptomyces hygroscopicus)Bar基因應用最廣且最成功。

近年來，研究人員培育出了一大批抗除草劑轉基因玉米品種。如抗咪唑啉酮玉米、抗稀禾定玉米、抗Liberty玉米、抗Poast玉米、抗草銨膦玉米、抗草丁膦玉米等。

2.2 抗蟲 蟲害是制約玉米生產的一大因素。傳統的化學殺蟲劑不僅殺死害蟲，還殺死了害蟲的天敵，造成生態平衡破壞和環境污染。轉基因玉米是代替殺蟲劑的更有效方法。

由于玉米螟泛濫，從蘇云金桿菌分離出的Bt毒蛋白基因就是針對這類鱗翅目昆蟲的，Bt毒蛋白在昆蟲幼蟲的腸道內微堿性條件下，經蛋白酶水解，轉變為毒性多肽分子，可與敏感昆蟲腸道上表皮細胞表面特異受體相互作用，擾亂細胞的滲透平衡，引起細胞腫脹甚至裂解，從而導致幼蟲停止進食最終死亡。隨后，針對鞘翅目、雙翅目的基因相繼發現。目前市面上已有好幾種Bt基因出售。

我國從1989年開始轉基因抗蟲育種。中國農業大學玉米抗蟲轉基因研究課題組將Bt毒蛋白基因轉入玉米獲得了有抗蟲性的轉化體，并在后代中分離出了正常遺傳的家系［5］。王國英等［6］成功地利用基因槍法把Bt基因轉移到玉米幼胚中，再生植株中CryIA基因得到表達。王景雪等［7］用花粉管通道法分別將幾丁質酶基因和Bt基因導入玉米。

由于長時間的單一種植，一些目標害蟲對抗蟲植株再次出現抗性，人們開始尋找新的抗性基因。近年來，研究人員在嘗試克隆植物來源的抗蟲轉基因代替微生物來源基因，主要涉及的基因有:①蛋白酶抑制劑抗蟲基因，如豇豆胰蛋白抑制劑基因(SCK)和豇豆胰蛋白抑制劑基因(CpTI)等。②植物外源凝集素(Lectin)基因，如雪花蓮凝集素基因(GNA)和半夏凝集素基因(pta)［8］。也有研究者建議轉基因和非轉基因植株混種，以延緩抗蟲群體暴發的時間。

2.3 抗病 玉米生長期間常受到病毒性病害(矮花葉病、玉米粗縮病等)、真菌性病害(玉米紋枯病)和細菌性病害等侵襲而使其品質及產量下降。

向玉米植株抗矮花葉病毒的能力轉入能與矮花葉病毒外殼蛋白基因互補的hpRNA后，玉米植株抗矮花葉病毒的能力顯著提高，研究還發現抗病能力與hpRNA發夾結構的長度相關［9］。沉默胱抑素基因(CC9)能有效地增強玉米植株對黑粉病的抗性［10］。向玉米中轉入一種來至大腸桿菌的核糖核酸內切酶基因，玉米植株表現出對玉米粗縮病的抗性［11］。將兔防御素基因(NP-1)導入玉米可有效抗大斑病［12］。

2.4 抗非生物脅迫 當農作物對除草劑、害蟲等獲得抗性成功后，研究者又把關注點移向非生物脅迫因子，如干旱、鹽堿、缺氮、少磷的環境。第一個商業化抗旱轉基因玉米品種是孟山都公司研發的Droughtgard玉米，該品種含有來源于枯草芽孢桿菌的cspB基因，冷休克蛋白cspB能與DNA或RNA結合，可以促進植物適應缺水環境。LU等［13］向玉米中轉入鉬輔因子硫化酶，WANG等［14］向玉米中轉入編碼磷脂酰肌醇磷脂酶ZmPLC1基因，AMARA等［15］在玉米中大量表達LEA Rab28蛋白，都增強了玉米對干旱的耐受性。

任小燕等［16］采用超聲波輔助花粉介導法將山菠菜膽堿單加氧酶(AhCMO)基因轉入玉米自交系“鄭58”中，結果表明，CMO的轉化提高了玉米的耐鹽性。付光明［17］將玉米表達甜菜堿醛脫氫酶后發現重組玉米具有較強的耐鹽性。

農作物生長發育需要各種營養元素，但我國部分土壤貧瘠，嚴重影響了糧食生產。針對缺氮、少磷的環境，大量的試驗正在進行。轉鹽芥H+焦磷酸酶(TsVP)玉米在磷酸鹽充足和缺乏的條件下都表現出比對照具有較強活力的根系，在磷酸鹽缺乏條件下，轉TsVP玉米生長、產量、繁殖能力都優于對照［18］。向玉米導入ZmPTF1基因，可溶性糖在葉片和根部的含量發生改變，對缺磷的耐受性顯著增強［19］。研究表明miRNA表達可以增強植株對N缺乏發生生理適應［20］。

3 展望

今天，轉基因產品已惠及大多數人，防治乙肝病毒的乙肝疫苗和治療糖尿病的胰島素目前都源自轉基因。由于玉米產量大，比單細胞發酵成本低，比從動物中提取更安全，研究人員開始運用玉米作為生物反應器，生產人們急需的糖類、氨基酸、維生素、醫用蛋白和生物燃料等。目前，我國正通過轉基因新品種培育重大專項整合國內大部分科研院所的資源，來加快玉米轉基因研究步伐，這對于解決我們面臨的環境惡化、資源匱乏、糧食短缺等問題具有重要作用。

［1］JAMES C.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2016［R］.ISAAA Brief 46，Ithaca，2014.

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