革木蜜的抗氧化活性*

賈歌，王遠(yuǎn)，豐凡，程妮，趙靜，曹煒，2

1(西北大學(xué)化工學(xué)院/西北大學(xué)蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，西安，710069)

2(陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，西安，710065)3(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京，100093)

自由基生物醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，機體中存在過多自由基可以直接攻擊細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損，引發(fā)很多疾病［1－2］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每日攝取一定量的蔬菜、水果、谷物，可以有效對抗動脈粥樣硬化和降低癌癥發(fā)病率其原因可能與其中含有大量的抗氧化成分有關(guān)。

近年來，蜂蜜的抗氧化活性受到廣泛關(guān)注，蜂蜜不僅在體外具有抗氧化活性，在體內(nèi)也有作用，這與蜂蜜中含有豐富的抗氧化成分有關(guān)［3－4］。曹煒等人研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自中國的槐花蜜、蘋果蜜、枸杞蜜、蕎麥蜜、山楂蜜等10種蜂蜜，對超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過氧化有明顯的抑制作用［5］。Isabel等人研究葡萄牙東北部的迷迭香蜜、石南蜜和牛舌草蜜的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)迷迭香蜜對DPPH自由基有較強的清除能力和抑制脂質(zhì)過氧化作用［6］。Zhou等人發(fā)現(xiàn)，蕎麥蜜對羥基自由基氧化損傷的DNA有較強的保護作用［7］。Saxena等采用FRAP法和DPPH法研究了印度蜂蜜的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)印度蜂蜜對自由基清除能力與酚酸含量呈正相關(guān)［8］，表明印度蜂蜜的抗氧化活性與其中含有的酚類化合物有關(guān)。Al-Mamary等人測定了也門產(chǎn)的5種蜂蜜的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)所有的蜂蜜對豬肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制率均超過50%，且蜂蜜的抗氧化能力與總酚含量呈高度相關(guān)［9］。

革木蜂蜜產(chǎn)自澳大利亞南部塔斯馬尼亞島［10］，色澤呈金黃色、質(zhì)感粘稠、香味濃郁，深受消費者的喜愛。目前，關(guān)于革木蜜中的抗氧化活性未見文獻報道。本文采用體外法對革木蜂蜜的抗氧化活性進行了研究，并與洋槐蜜和蕎麥蜜進行了。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 材料

革木蜜，由寧波保稅區(qū)圣鯨酒業(yè)有限公司提供(Australian Honey Products P/L-Tasmania 7250 Australia出品)，洋槐蜜和蕎麥蜜，由陜西老蜂農(nóng)生物有限責(zé)任公司提供。樣品信息見表1。

表1 單花蜜樣品信息表Table 1 Unifloral samples information table

1.1.2 試劑

1，1-苯基-2 苦肼基自由基(DPPH)、3-(2-吡啶基)-5，6-雙(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(Ferrozine 試劑)、2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪(TPTZ)，Sigma 公司產(chǎn)品。GoldViewⅠ型核酸染色劑，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。沒食子酸、硫酸亞鐵(FeSO4)、Na2HPO4、乙二氨四乙酸(EDTA)、NaH2PO4、三氯化鐵(FeCl3)等，均為市售分析純試劑。瓊脂糖，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。XAD-2大孔樹脂，上海摩速科學(xué)器材有限公司產(chǎn)品。pBR322 DNA，TaKaRa生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 實驗儀器

電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，UV751-GD紫外/可見分光光度計(上海分析儀器總廠)，D-9143B-1型鼓風(fēng)干燥箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 革木蜜總酚含量和總黃酮含量的測定

1.3.1.1 總黃酮含量的測定［11］

(1)黃酮的提取:準(zhǔn)確稱取樣品10 g，加90 mL蒸餾水溶解并定容至100 mL，將XAD-2大孔樹脂裝入柱中并水洗至無醇味，然后用玻璃棒將蜂蜜溶液緩慢轉(zhuǎn)入柱中。用大于200 mL的酸水和蒸餾水將糖等極性化合物洗脫，再用200 mL甲醇洗脫至無色，收集甲醇洗脫液，40℃減壓濃縮至干，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，作為供試液。

(2)標(biāo)品的配置:精確稱取在105℃條件下干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇，微熱溶解，放冷后再加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、10、20、30、40、50 μL 于10 mL 試管中，加入甲醇定容至4 mL，加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL充分搖勻，靜置6分鐘，加入10%的硝酸鋁0.4 mL，靜置6分鐘，再加入4%氫氧化鈉4 mL，用甲醇定容至10 mL，靜置15分鐘，在430 nm處測其吸光度。

1.3.1.2 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法［12］測定。以對照品的吸光度和對照品的濃度(mg/mL)進行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。回歸方程:y=0.099 3x+0.136 8(R2=0.997 0)。蜂蜜總酚含量以沒食子酸的相對量表示。

1.3.2 革木蜜對DPPH自由基的清除實驗

采用 Yokozawa［13］和 Larrauri［14］的方法進行。吸取一定量稀釋后的蜂蜜樣品，加入0.025 mg/mL的DPPH甲醇溶液3 mL，用蒸餾水定容至5 mL。在室溫、避光條件下放置1 h后于516 nm處測吸光度。DPPH的清除率用以下公式計算:

DPPH自由基清除率/%=(1－A”1/A0)×100

式中A0為體系中空白吸光度(沒有加入樣品);A1為某時刻溶液中樣品的吸光度。清除50%DPPH自由基時所需蜂蜜的量，即為所測樣品的 IC50值。IC50值越小，表明蜂蜜的抗氧化活性越大。

1.3.3 革木蜜對Fe3+還原能力(FRAP)實驗

革木蜜對Fe3+還原力參考Tuberoso等人［15］的實驗方法并適當(dāng)進行改進。移取0.2 g/mL的蜂蜜溶液0.5 mL于10 mL試管中，然后加入4 mL TPTZ工作液(包含2.5 mL的10 mol/L TPTZ溶液，2.5 mL的20 mmol/L FeCl3溶液及25 mL的300 mmol/L pH為3.6的醋酸鹽緩沖液)，混勻后37℃反應(yīng)10 min，在593 nm測定吸光度。

1.3.4 革木蜜對Fe2+絡(luò)合力實驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別移取 0、60、120、180、240、300、360 μL Na2EDTA(1 mg/mL)溶液于 10 mL 試管中，加入 FeSO4(1 mM)100 μL，ferrozine(1 mol/L)300 μL，用甲醇定容至3 mL，然后在562 nm處測定吸光度。回歸方程:y=－71.900x+0.920 1(R2=0.997 8)。

將稀釋后的蜂蜜樣品吸取200 μL于10 mL試管中，加入 100 μL 1 mM FeSO4溶液，300 μL 1 mol/L ferrozine溶液，用甲醇定容至3 mL，于562 nm處測定吸光度。

1.3.5 革木蜜對羥基自由基致DNA氧化損傷的保護實驗

將瓊脂糖加熱熔化，于25 mL瓊脂糖中趁熱加入1 μL GoldView染色。在1.5 mL離心管中加入1 μL 0.25 μg pBR322 DNA，1 μL 1 mmol/L FeSO4，1 μL 1%H2O2，5 μL 蜂蜜樣品溶液，用50 mol/L PBS 緩沖液(pH=7.0)定容至15 μL，充分混合，置于37℃溫浴30 min，用Loading buffer染色，然后在0.8%的瓊脂糖凝膠中避光電泳，電泳結(jié)束后放凝膠于凝膠呈像儀中呈像，用Quantity One 4.6.2軟件(Bio-Rad公司)進行DNA損傷度評價。

1.4 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。方差分析采用SPSS 13.0分析軟件中ANOVA單因素分析，P＜0.05說明有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜樣品的總酚含量和總黃酮含量

由表2可知，3種蜂蜜樣品間的總酚含量和總黃酮含量有顯著差異。蕎麥蜜中總酚含量和總黃酮含量分別為(127.63±4.41)μg/g、(0.058 16±0.002)mg/g，顯著高于革木蜜和洋槐蜜的總酚含量和總黃酮含量。3種蜂蜜的總酚和總黃酮含量順序為:蕎麥蜜＞革木蜜＞洋槐蜜。3種不同蜂蜜樣品中的總黃酮含量遠(yuǎn)小于總酚含量，由此可見，革木蜜中抗氧化成分主要為酚酸。曹煒［16］等人報道的荊條蜜、黨參蜜、黃芪蜜、枸杞蜜和枇杷蜜的酚酸含量，革木蜜酚酸含量與荊條蜜相當(dāng)，但顯著高于黨參蜜、黃芪蜜和枸杞蜜。革木蜜中總黃酮的含量大于椴樹蜜黃酮［17］。

2.2 革木蜜對DPPH自由基的清除作用

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，常用于評價天然抗氧化劑和提取物的抗氧化活性。本文考察了革木蜜對DPPH自由基的清除活性，并與蕎麥蜜和洋槐蜜進行了比較，結(jié)果見圖1。由圖1可知，革木蜜、洋槐蜜和蕎麥蜜清除DPPH自由基的能力不盡相同，且樣品濃度增加時清除率隨之增強。對圖1進行曲線擬合得出各種蜂蜜的IC50值。革木蜜、蕎麥蜜和洋槐蜜對DPPH自由基的IC50值分別為(0.080 6±0.005)、(0.036 2 ±0.004)、(0.366 ±0.021 2)g/mL。由此可見，革木蜜對DPPH自由基的清除活性高于洋槐蜜，但低于蕎麥蜜。相關(guān)性分析表明，蜂蜜樣品對DPPH自由基與酚酸含量呈正相關(guān)(R=0.82)，與黃酮含量也呈正相關(guān)性(R=0.93)，由此說明，黃酮及酚酸是3種蜂蜜清除DPPH自由基的主要成分，且黃酮類化合物對DPPH自由基的清除活性更顯著。

圖1 蜂蜜對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging activities of honey samples on DPPH radicals

2.3 革木蜜對Fe3+還原能力(FRAP)

FRAP法測定總抗氧化能力的原理是在低pH值的環(huán)境下，生物活性物質(zhì)能夠?qū)⑷拎と喝齼r鐵還原為藍(lán)色的三吡啶三嗪二價鐵，在593 nm測定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。FRAP是唯一直接測定樣品抗氧化活性的方法。由表2可知，革木蜜對Fe3+的還原力遠(yuǎn)高于洋槐蜜，但低于蕎麥蜜。最強與最弱之間相差11倍。與Bertoncelj等人測定的刺槐蜜、檸檬蜜、栗子蜜和云杉蜜等幾種單花蜜的 FRAP值相比［18］，革木蜜的 FRAP值顯著高于刺槐蜜、檸檬蜜、栗子蜜和云杉蜜的FRAP值。總酚含量與3種蜂蜜的FRAP值相關(guān)系數(shù)為R=0.99，表明3種蜂蜜對Fe3+的總抗氧化能力與總酚含量有關(guān)。酚類化合物具有較強的還原性，因而具有較強的提供電子能力，這也是蜂蜜能夠還原Fe3+的主要原因，也是蜂蜜發(fā)揮抗氧化活性的化學(xué)本質(zhì)。

表2 蜂蜜樣品總酚含量，總黃酮含量和對Fe3+還原能力(ˉx ± s)Table 2 The total phenolic，total flavonoids contents and FRAP of honey samples(ˉx ± s)

2.4 革木蜜對Fe2+的絡(luò)合力

絡(luò)合過渡金屬離子是評價抗氧化活性大小的重要指標(biāo)之一。過渡金屬離子可以催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抗氧化物通過絡(luò)合金屬離子實現(xiàn)減緩脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到抑制脂質(zhì)過氧化的作用。Ferrozine能夠與Fe2+定量發(fā)生絡(luò)合生成藍(lán)色物質(zhì)，能將金屬離子有效絡(luò)合，當(dāng)反應(yīng)體系存在其他絡(luò)合物時(例如黃酮類化合物)，該物質(zhì)能夠爭奪Fe2+使得藍(lán)色變淺，顏色越淺表明絡(luò)合能力越強［19］。由圖2可知，在3種蜂蜜中，洋槐蜜對Fe2+的絡(luò)合力最強，其絡(luò)合力為1 g洋槐蜜相當(dāng)于0.209 mg Na2EDTA，蕎麥蜜對Fe2+絡(luò)合力最弱。由此可見，酚酸含量與Fe2+絡(luò)合力無明顯相關(guān)性，這與Zhou等人研究的總酚含量最高的蕎麥蜜樣品并不是Fe2+絡(luò)合力最強的樣品結(jié)果一致［6］。由于這3種蜂蜜來自不同的蜜源，其含有的抗氧化活性物質(zhì)不同，酚類化合物的結(jié)構(gòu)也不同，因此對Fe2+絡(luò)合能力不同［20］。此外，蜂蜜中可能存在一些其他抗氧化物質(zhì)，也可能影響其對Fe2+的絡(luò)合能力。

2.5 革木蜜對羥基自由基致pBR322 DNA氧化損傷的保護作用

圖2 蜂蜜對Fe2+的絡(luò)合力Fig.2 The iron chelation of honeys

在羥基自由基誘導(dǎo)的DNA損傷中，未處理的質(zhì)粒pBR322 DNA主要以超螺旋型形式存在(見泳道1)。當(dāng)在體系中加入H2O2和Fe2+后發(fā)生Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基，進而導(dǎo)致DNA發(fā)生氧化損傷。氧化損傷后的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)型和直鏈型DNA，電泳速度明顯慢于超螺旋結(jié)構(gòu)(見泳道2)。由圖3可知，對照組的 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)比例為83.3%(泳道1)，為經(jīng)損傷后的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)比例下降為38.6%(泳道2)，表明DNA發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷。當(dāng)在體系中加入3種蜂蜜后，超螺旋結(jié)構(gòu)比值分別為71.5%、56.7%和73.1%，顯著高于氧化損傷組(泳道2)，表明3種蜂蜜對羥基自由基誘導(dǎo)的pBR322 DNA氧化損傷均有顯著的保護作用(泳道3～5)。其中革木蜜對羥基自由基誘導(dǎo)的 pBR322 DNA氧化損傷的保護能力介于洋槐蜜和蕎麥蜜之間。表明革木蜜是一種活性較強的DNA氧化損傷保護劑。

圖3 蜂蜜樣品對羥基自由基致pBR322 DNA氧化損傷的保護作用泳道1:空白(只含pBR322 DNA);泳道2:H2O2+Fe2++pBR322 DNA;泳道3－5:H2O2+Fe2++pBR322 DNA+1 μL濃度為0.2 mg/mL的革木蜜、洋槐蜜和蕎麥蜜樣品(DNA損傷保護)。Fig.3 Protective activity of honey samples on hydroxyl radical-mediated DNA damage.Lane 1，no addition(only pBR322 DNA);Lane 2，F(xiàn)eSO4，H2O2and pBR322 DNA;Lanes 3 －5，F(xiàn)eSO4，H2O2，pBR322 DNA and 1 μl leatherwood honey，acacia honey and buckwheat honey samples with concentration of 0.2 mg/ml，respectively(DNA damage protection).

活性氧是導(dǎo)致DNA氧化損傷主要原因，尤其是羥基自由基具有極強的攻擊能力，直接導(dǎo)致DNA開環(huán)、堿基修飾甚至發(fā)生斷鏈。雖然機體內(nèi)有一套修復(fù)DNA氧化損傷的機制，能夠及時修復(fù)氧化損傷后的DNA分子，但外源抗氧化劑對預(yù)防氧化應(yīng)激導(dǎo)致的生物大分子損傷至關(guān)重要。蜂蜜中含有大量的抗氧化成分，在體內(nèi)和體外均具有顯著的抗氧化活性［3，21］。本文研究結(jié)果表明，革木蜜的總酚含量雖顯著低于蕎麥蜜，但二者對DNA氧化損傷的保護能力未見顯著差異，且革木蜜對Fe2+的絡(luò)合力顯著高于蕎麥蜜(P＜0.05)，表明革木蜜對羥基自由基誘導(dǎo)DNA損傷的保護作用可能通過清除羥基自由基和絡(luò)合Fe2+雙重機制發(fā)揮作用，其分子機理有待進一步深入研究。另外革木蜜中的主要抗氧化成分的結(jié)構(gòu)也需要進一步表征，為揭示其抗氧化的分子機制和構(gòu)效關(guān)系提供依據(jù)。

3 結(jié)論

(1)體外實驗表明，革木蜜對DPPH自由基有較強的清除活性，IC50值介于蕎麥蜜和楊槐蜜之間;FRAP實驗表明，革木蜜具有的還原力顯著高于楊槐蜜，但低于蕎麥蜜。

(2)革木蜜對羥基自由基致DNA氧化損傷有顯著的保護作用，這可能與革木蜜具有較強的還原力和對過渡金屬的絡(luò)合力有關(guān)。

(3)革木蜜的抗氧化活性與總酚含量有關(guān)。本文的研究結(jié)果顯示，革木蜜是一種具有抗氧化保健功能的天然食品。

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