解脂耶羅維亞酵母菌利用地溝油聯產檸檬酸和胞內油脂*

柯智健，孫磊，曹麗，常歡歡，劉曉燕

1(淮陰師范學院生命科學學院，江蘇淮安，223300)

2(淮陰師范學院江蘇省生物質能源與酶技術重點實驗室，江蘇淮安，223300)

檸檬酸是一種重要的有機酸，被廣泛應用于食品業、農業和醫藥業等眾多領域，其生產開發存在著廣闊的拓展空間［1］。目前檸檬酸工業生產主要通過黑曲霉(Aspergillus niger)利用淀粉質糧食原料發酵獲得。近年來，糧食發生世界性短缺而價格飛漲，我國的檸檬酸低成本生產優勢在不斷減小;同時，檸檬酸傳統工業生產菌株黑曲霉也因其致病性而受到人們的質疑，因此，尋找低價的生產原料和安全的生產菌株成為檸檬酸發酵產業的當務之急［2］。

隨著世界能源危機愈演愈烈，化石燃料的替代能源——可再生生物柴油的研究炙手可熱。生物柴油的生產幾乎可以采用所有的天然油脂為原料，包括微生物產生的油脂。產油微生物能在農副產品及食品工業產生的廢棄物中生長并生產胞內油脂，可緩解動植物油脂作為生物柴油原料的緊缺局面，從而有效降低生物柴油的生產成本，因此微生物胞內油脂的開發利用已成為研究的熱點［3］。

近年來，解脂耶羅維亞酵母菌(Yarrowia lipolytica)因較高的發酵檸檬酸產量而受到研究者的普遍關注。Y.lipolytica是一種常見的好氧菌，對人類健康無任何危害，該菌在氧氣充足和碳源過剩的情況下，可產生大量的檸檬酸［4］，是檸檬酸發酵工業中獨具潛力的A.niger替代菌株。Y.lipolytica能夠在油脂為唯一碳源的培養基中生長并生產相關產物［5-7］，除了高產檸檬酸外，Y.lipolytica還是一種重要的微生物油脂生產菌株，該菌經過改造后以油脂為原料其胞內油脂累積量可達到61.7%［8］。

地溝油是從餐飲業廢水中提取的不可再食用油脂，含多種有害成分，有很強的致癌性［9］。然而由于價格低廉，地溝油回流至餐飲業的不法現象屢禁不止，給社會帶來巨大危害。地溝油屬于混合油脂，可作為Y.lipolytica生產檸檬酸和胞內油脂的碳源，而地溝油中的有害成分可在檸檬酸和胞內油脂發酵及提純過程中去除［2］。基于此，本研究以Y.lipolytica為發酵菌株，以廉價地溝油為生產原料，通過條件優化及發酵控制，實現檸檬酸及胞內油脂的同時發酵生產，為降低兩種產物的發酵成本，實現地溝油的合理利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的菌株為解脂耶羅維亞酵母菌(Yarrowia lipolytica SWJ-1b)，該菌分離自渤海魚類腸道。

1.1.2 原料

實驗所用地溝油收集自當地廢棄油脂回收站。

1.1.3 培養基

YPD(yeast extract peptone dextrose medium)固體培養基(g/L):葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母粉10.0，瓊脂粉 20.0。

YPD液體培養基(g/L):葡萄糖 20.0，蛋白胨20.0，酵母粉 10.0。

發酵培養基(g/L):地溝油或甘油，(NH4)2SO40.2，KH2PO42.0，Na2HPO410.0，MgSO4·7H2O 1.5，CaCl20.2，ZnSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.06，酵母提取物 0.3，硫胺素 0.006，用濃 HCl調pH至6.0，在115℃下滅菌30 min，冷卻后加入過濾除菌的1.6%(w/v)溴甲酚紫指示劑［3］。

1.2 方法

1.2.1 種子液的培養

Y.lipolytica SWJ-1b菌株在YPD固體培養基上活化后，挑取單菌落接種于 YPD液體培養基中，28℃，180 r/min振蕩培養至菌體濃度達到OD600=30.0。

1.2.2 發酵培養

上述菌液接種至發酵培養基中，28℃下振蕩培養。根據培養基中指示劑顏色變化用2.0 mol/L KOH調節pH，使之保持在6.0左右，直至指示劑顏色不再變化，說明發酵結束［4］。

1.2.3 菌體顯微形態觀察

發酵結束時，直接取樣在相差顯微鏡下觀察拍照，放大倍數為40×10。

1.2.4 發酵液中檸檬酸含量測定

利用高效液相色譜分析法測定發酵液中的檸檬酸含量。色譜及檢測條件為:色譜柱類型:Agilent Zorbax NH2column(5.0 μm，4.6 mm ×250.0 mm);流動相:10.0 mmol/L(NH4)2HPO4溶液(pH 2.7);流速:0.5 mL/min;進樣量:20.0 μL;溫度:25 ℃;紫外檢測波長:210 nm。

1.2.5 菌體油脂含量測定及提取

發酵液在5 000 r/min下離心5 min，去除上清，所得菌體用正己烷離心洗滌2～3次去除細胞表面油脂，放入80℃烘箱烘至恒重，稱量細胞干重。將烘至恒重的菌體在研缽中研磨后，利用索氏提取法提取胞內油脂，并計算菌體油脂含量［10］。

1.2.6 油脂成分分析［8］

上述步驟所得油脂利用Agilent 6890氣相色譜儀分析其成分。色譜柱:JH-FFAP石英毛細管柱(50m ×0.32 mm ×0.25 μm);柱溫:程序升溫，80℃—150℃(5℃/min，停留5 min)—250℃(3℃/min);FID檢測溫度:280℃;進樣口溫度:260℃;載氣:99.999%氮氣;載氣流速:1.2 mL/min;分流比:1∶50;進樣量:1 μL。

1.2.7 培養基中地溝油含量測定

發酵過程中發酵培養基的油脂含量測定參照ZHAN 的方法［11］。

1.2.8 發酵條件對產物產量的影響

發酵培養基的地溝油初始濃度為40.0 g/L，分別以 104、105、106、107、108、109、1010個細胞/L 培養基的發酵液菌體濃度進行接種，考察接種量對產物產量的影響;發酵培養基的地溝油初始濃度分別為30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0 g/L，考察碳源初始濃度對產物產量的影響;在地溝油初始濃度為80.0 g/L，接種量為5×108個細胞/L培養基的情況下，分別以 100、120、140、160、180、200、220 r/min 的搖床轉速進行發酵培養，考察培養轉速對產物產量的影響。

2 結果與分析

2.1 Y.lipolytica SWJ-1b分別以甘油和地溝油為碳源的發酵情況比較

甘油是Y.lipolytica SWJ-1b發酵產檸檬酸較好的原料之一［2，4］，我們將 Y.lipolytica SWJ-1b 分別在以甘油和地溝油為碳源(濃度40.0 g/L)的發酵情況進行了比較。圖1a和圖1b分別是Y.lipolytica SWJ-1b在甘油和地溝油發酵培養基中的細胞形態的顯微照片，其中，圖1b中的酵母細胞內存在明顯的油滴，初步證明Y.lipolytica SWJ-1b以地溝油為原料時有大量胞內油脂的累積。圖2數據顯示，以地溝油為碳源時的檸檬酸產量(21.8 g/L)略低于以甘油為碳源的檸檬酸產量(23.1 g/L)，但胞內油脂的含量(32.3 g/100 g細胞干重)卻明顯高于后者(15.6 g/100 g細胞干重)，這說明地溝油可以作為Y.lipolytica SWJ-1b同時產檸檬酸和胞內油脂的原料。

圖1 Y.lipolytica SWJ-1b分別在甘油和地溝油發酵培養基中的細胞形態(放大倍數10×40)Fig.1 The cell morphology of Y.lipolytica SWJ-1b in the medium containing glycerol and illegal cooking oil respectively(Magnification 10×40)

圖2 Y.lipolytica SWJ-1b分別以甘油和地溝油為碳源的產物產量Fig.2 Products yields of Y.lipolytica SWJ-1b from illegal cooking oil and glycerol respectively

2.2 菌株接種量對產物產量的影響

發酵過程是微生物細胞參與的生物化學反應過程，產物的生物合成受微生物細胞的數量及代謝情況的影響。一般情況下，菌體濃度越高，產物產量也高;但是菌體濃度過高，過量的菌體則會呼吸消耗碳源及營養物質，引起培養基溶氧不足，反而降低產物產量［12］，因此需確定發酵的最佳接種量。由圖3可知，隨著接種量的增加，檸檬酸和油脂產量提高，當接種量分別為108及109個細胞/L培養基時，檸檬酸和油脂產量分別達到最高(22.1 g/L，33.6 g/100 g細胞干重)，之后隨著接種量進一步提高，檸檬酸及油脂產量下降。根據以上實驗結果，我們采用的接種量為5×108個細胞/L培養基。

圖3 接種量對產物產量的影響Fig.3 Effects of inoculation size on the yields of products

2.3 地溝油含量對產物產量的影響

Y.lipolytica產檸檬酸及胞內油脂的先決條件是培養基碳源過剩，因此碳源濃度對這2種產物的產量有重要影響。理論上產物產量應隨碳源濃度提高而增高，而事實往往并非如此。在我們之前的研究中，Y.lipolytica 87利用菊粉產檸檬酸時，菊粉的最佳初始濃度為100.0 g/L，培養基菊粉初始濃度過高或過低所得的檸檬酸產量均不理想［13］;而在Anita等的研究中，Y.lipolytica Wratislavia AWG7利用甘油發酵檸檬酸的最適濃度為50.0 g/L，碳源濃度進一步提高則檸檬酸產量有所下降［14］，由此可見培養基碳源濃度對產物產量有直接影響。由圖4可知，當培養基中碳源濃度較低時，檸檬酸及油脂產量均隨碳源濃度提高而提高，碳源濃度增至80.0 g/L時，檸檬酸及油脂產量均達最高值(33.5 g/L，43.8 g/100 g細胞干重)，之后隨培養基中地溝油濃度進一步提高，二者產量均出現下降趨勢，這說明80.0 g/L是Y.lipolytica利用地溝油同時生產檸檬酸及油脂的最佳初始碳源濃度。

圖4 地溝油含量對產物產量的影響Fig.4 Effects of the initial concentrations of illegal cooking oil on the yields of products

2.4 培養轉速對產物產量的影響

微生物合成油脂及檸檬酸都是需氧的過程，因此供氧量對這2種產物的產量都有很大影響。其中，產油真菌在供氧缺乏條件下，甘油三酯合成會強烈受阻，并大量積累磷脂和游離脂肪酸;而產檸檬酸菌株在氧氣不足時，碳源則主要通過糖酵解途徑消耗，而很少進入TCA循環進而生成檸檬酸。本部分實驗通過控制培養過程的搖床轉速來控制發酵過程中的供氧量，在圖5中，隨搖床轉速增加，產物產量增加，當轉速為180 r/min時，檸檬酸及胞內油脂產量均達到最高，而菌體生物量則隨轉速的提高而降低。

圖5 搖床轉速對產物產量的影響Fig.5 Effects of rotate speeds of shaker on the yields of products

2.5 發酵過程產物含量變化趨勢

在培養基地溝油濃度為80.0 g/L，接種量為5×108個細胞/L培養基及培養轉速為180轉/分鐘的培養條件下，檸檬酸及油脂產量變化趨勢如圖6所示。從圖6可以看出，在發酵的前72 h主要為菌體生長階段，此時檸檬酸及油脂的生成很少;發酵的72～120 h，主要為油脂合成階段，此時菌體已基本停止生長，油脂含量迅速增至44.9 g/100g細胞干重;發酵的120 h以后，檸檬酸產量大幅提高，直至發酵結束，檸檬酸產量達到最高(33.6 g/L)。而此期間油脂含量基本保持恒定，只在發酵后期出現輕微下降，原因可能是有少量油脂被水解用于檸檬酸的合成。由此可見，Y.lipolytica利用地溝油發酵過程包括3個階段:細胞生長階段，油脂合成階段和檸檬酸合成階段，這與之前Makri等報道的結果基本吻合［15］。

圖6 發酵過程產物產量變化Fig 6 Time course of cell growth，citric acid production and the accumulation of intracellular lipid.

據Levinson等報道，Y.lipolytica YB-423以甘油為原料時能夠產生21.6 g/L檸檬酸［4］;Y.lipolytica ACA-DC 50109以橄欖處理廠廢料為原料發酵檸檬酸的產量為28.9 g/L［16］，而本研究中以地溝油為原料時發酵檸檬酸產量則達33.6 g/L，這說明與其他碳源相比，地溝油是Y.lipolytica發酵檸檬酸的良好原料。在生產胞內油脂方面，趙春海等報道Y.lipolytica ACA-DC50109分別以葡萄糖、果糖、蔗糖及菊粉等糖類物質為原料的胞內油脂產量均僅為30.0 g/100g細胞干重左右［17］，而 Y.lipolytica SWJ-1b以地溝油為原料時的胞內油脂累積量則達到44.9 g/100g細胞干重，表明地溝油作為生產胞內油脂的原料同樣具有明顯優勢。

2.6 地溝油和胞內油脂成分比較

利用氣相色譜法分別分析地溝油及胞內油脂的主要脂肪酸成分，結果如表1所示。從表1可以看出，胞內油脂中，飽和脂肪酸油酸的含量遠低于地溝油，而亞油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量則高于地溝油，這說明地溝油經微生物利用并生成胞內油脂的過程中，油脂的飽和性降低。Papanikolaou等研究發現，胞內油脂的飽和性與底物濃度及發酵時間有密切關系，底物濃度越高，胞內油脂的不飽和度就越高［18］，原因可能在于微生物胞內與脂肪酸合成有關的酶受著底物濃度及發酵時間的調控。

表1 地溝油及胞內油脂主要脂肪酸組成 %Table 1 Fatty acid composition of illegal cooking oil and the intracellular lipid of Y.lipolytica SWJ-1b

3 結論

本文以Y.lipolytica SWJ-1b為發酵菌株，利用地溝油進行檸檬酸和胞內油脂的同時發酵，并對該發酵過程中檸檬酸和胞內油脂同時保持較高產量的最佳條件進行探索，在最佳發酵條件下，檸檬酸和胞內油脂的產量分別達到33.6 g/L和44.9 g/100g細胞干重，該發酵過程包括3個階段，即細胞生長階段，油脂合成階段和檸檬酸合成階段。地溝油合成胞內油脂后，其脂肪酸飽和程度降低。由此可見，地溝油是Y.lipolytica SWJ-1b聯產檸檬酸和胞內油脂的理想原料。

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