基于二階變換的高效液相色譜法測定食品中丙烯酰胺

徐立恒 王 笑 葉艷芬

(中國計量學院質量與安全工程學院，杭州 310018)

基于二階變換的高效液相色譜法測定食品中丙烯酰胺

徐立恒 王 笑 葉艷芬

(中國計量學院質量與安全工程學院，杭州 310018)

針對方便面等面粉類食品中丙烯酰胺的測定，建立了基于二階變換的高效液相色譜測定方法。該方法將二階變換處理技術應用于HPLC的數據分析和處理，可以使食品樣品HPLC圖中丙烯酰胺色譜峰得到顯著的銳化，大大提高定量分析的準確度和靈敏度。該方法測定丙烯酰胺的線性范圍寬泛，定量檢測限(LOQ)<10 μg/L，加標回收率為88.3%～91.0%，明顯優于不經二階變換處理的HPLC法。采用該方法對市售方便面樣品進行測定，發現丙烯酰胺含量在10～300 μg/kg范圍內，其含量小于薄脆餅干等常見的面粉類食品。

二階變換 HPLC 信號處理 食品 丙烯酰胺

丙烯酰胺是食品在熱加工過程中部分氨基酸和還原糖反應形成的產物，廣泛存在于熱加工的淀粉類食品中，比如油炸薯類制品、咖啡和谷物早餐[1-3]。由于丙烯酰胺具有潛在的神經毒性、遺傳毒性和致癌性(IIA類)[4-5]，對人們的健康存在巨大威脅，自從2002年首次在食品中被發現以來引起了人們的高度重視。在我國人民的飲食結構中，小麥粉類食品包括煎、炸、烤等熱加工工藝生產的面粉類食品占有重要的位置，建立小麥粉類食品中丙烯酰胺的檢測方法、監測丙烯酰胺的濃度水平是評估丙烯酰胺攝入量和健康風險、指導食品加工工藝的必然要求。

高效液相色譜(HPLC)是復雜體系分離分析的良好手段，在食品中丙烯酰胺的測定中得到了廣泛的應用[6-8]。但是對于丙烯酰胺含量很低的食品樣品，普通的液相色譜很難滿足測定要求，通常需要采用液相色譜串聯質譜甚至質譜/質譜來進行分析，對儀器條件提出了更高的要求，很難在日常監測中應用。

二階變換是一種簡便的信號處理技術，可以有效的放大信號、增強峰的識別能力，并減少基線漂移等的影響，近年來在光譜信號處理以及定量定性分析中得到了廣泛的應用[9-11]。將二階變換信號處理技術應用于HPLC的數據分析和處理，可以使低濃度組分的較小色譜峰得到顯著銳化，有效提高檢測方法的靈敏度，有希望解決低含量組分的測定問題。本文采用二階變換對HPLC的信號進行數據處理，建立適用于低含量食品中丙烯酰胺的高效液相色譜測定技術，并應用該方法對市售方便面樣品丙烯酰胺含量進行了測定。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；LG10-2.4A高速離心機：北京京立離心機有限公司；VisiprepTMDL固相萃取裝置：美國Supelco公司；HC-C18固相萃取小柱：上海安譜科學儀器有限公司。

丙烯酰胺標準品(≥99%)、甲醇(色譜純)、正己烷(色譜純)：百靈威科技有限公司；其余試劑均為分析純。CarrezⅠ試劑：15.00 g三水合亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6·3H2O)溶解于水中并稀釋至100 mL；CarrezⅡ試劑：30.00 g七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)溶解于水中并稀釋至100 mL。餅干樣品為市場隨機采集，均在保質期內，按要求條件貯藏。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent公司ZORBAX SB-C18色譜柱；流動相：10%甲醇-水；流速：0.5 mL/min；進樣量：15 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。

1.3 樣品預處理

將方便面樣品粉碎后準確稱取樣品5 g于100 mL燒杯中，加入30 mL水，磁力攪拌20 min后轉入離心管中，以4 000 r/min轉速離心30 min；移取上層清液于分液漏斗中，加入正己烷萃取3次以除去油脂；移取除脂后的樣品液10mL于離心管中，分別加入CarrezⅠ、CarrezⅡ試劑各5 mL，混勻靜置20 min后，以4 000 r/min轉速離心20 min以除去蛋白質；上清液經活化的HC-C18固相萃取柱純化，流出液用于HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 二階變換信號處理應用于HPLC法定量分析

二階變換是一種簡便的信號處理方法，采用二階變換對色譜流出曲線進行處理，可得：

式中：x為保留時間，y為信號強度。例如，圖1a所示為丙烯酰胺標準樣品在HPLC上進行分析得到的流出曲線，保留時間4.32 min的色譜峰即為丙烯酰胺的色譜峰。將HPLC流出曲線進行二階求導變換，結果如圖1b所示，流出曲線中丙烯酰胺的色譜峰變成了一個尖銳的倒峰。與原色譜峰相比，二階變換以后的色譜峰峰高得到了顯著的放大，并且峰寬明顯變小，色譜峰變得更加尖銳、易于識別和分析。

HPLC法通常通過峰高或峰面積進行定量分析。

圖1 丙烯酰胺標樣的HPLC流出曲線(a)和經二階變換處理的流出曲線(b)

在二階變換以后的色譜圖中，我們選用色譜峰峰高的絕對值作為丙烯酰胺定量分析的依據，得到的標準曲線見圖2。如圖2所示，在丙烯酰胺質量濃度為10～500 μg/L范圍內，絕對峰高與丙烯酰胺的濃度呈良好的線性關系，其線性相關系數達0.999 8，可見二階變換色譜圖的絕對峰高完全可以作為定量分析的特征值，可以滿足定量分析的要求。采用該方法對丙烯酰胺進行定量分析時線性范圍寬泛，其定量限(LOQ)可低至10 μg/L，與文獻報道的HPLC-MS/MS方法相當[6]。

圖2 二階變換處理色譜圖的絕對峰高與丙烯酰胺濃度關系

2.2 食品樣品色譜圖的二階變換

食品中丙烯酰胺的含量隨食品種類、加工方式等的變化而不同，歐洲食品安全局對10 000多份樣品檢測結果表明，丙烯酰胺的含量在幾十到幾千μg/kg范圍內[12]。對于丙烯酰胺含量較低的樣品，直接HPLC法很難對其進行定量分析。

圖3 某方便面樣品的HPLC流出曲線(a)和二階變換流出曲線(b)

圖3a為一方便面樣品的HPLC色譜圖，由圖3a可見，丙烯酰胺的色譜峰不明顯，峰高較低且峰寬較大，與相近色譜峰分離不完全，而且色譜曲線的基線漂移明顯，這些都為色譜峰的確認和峰面積的計算帶來嚴重干擾，因此無法準確的進行定量分析。對該樣品的色譜圖進行二階導數變換處理，結果如圖3b所示，在保留時間4.32 min的色譜二階導數峰變得非常尖銳，與相鄰峰分離良好，經與加標樣品相對比可以確認為丙烯酰胺的特征信號。因此，將二階變換信號處理技術HPLC法相結合測定食品中的丙烯酰胺，可以大大提高定量分析的準確性和靈敏度。

2.3 基于二階變換的HPLC法測定方便面中的丙烯酰胺

試驗采用基于二階變換的HPLC法對市售方便面樣品的丙烯酰胺含量進行測定，首先考察該方法的回收率和精密度，以衡量測定方法可靠性。加標回收試驗的結果如表1所示，可以發現基于二階變換的HPLC法加標回收率在88.3%～91.0%之間，與不經二階變換數據處理的經典HPLC法計算結果相對比，回收率普遍顯著提高。在同一試驗條件下同一方便面樣品進行多次重復測定(n=8)，得到基于二階變換的HPLC法的相對標準偏差(RSD)為5.8%。該方法回收率和精密度良好，能滿足測定的需要。

表1 加標回收率試驗結果

對超市銷售的方便面隨機抽取27個樣品，按照基于二階變換的HPLC法測定丙烯酰胺含量，每個樣品重復測定3次(圖4)。除3個樣品未檢出以外，其余方便面樣品均含有丙烯酰胺，含量基本在10～300 μg/kg范圍內，其中11個樣品的丙烯酰胺含量小于50 μg/kg，大于150 μg/kg的樣品有4個。與歐洲食品安全局的測定結果相對比[12]，方便面中丙烯酰胺的含量低于薄脆餅干和烘脆面包中丙烯酰胺的含量，與軟面包的含量相當。盡管方便面的加工溫度較高，但其比較低的糖含量可能減少了加工過程丙烯酰胺的形成。

圖4 方便面樣品的丙烯酰胺含量

3 結論

本研究將二階變換數據處理技術應用于高效液相色譜分析法，建立了一種食品中丙烯酰胺的測定方法。二階變換處理可以使食品樣品HPLC圖中丙烯酰胺色譜峰得到顯著銳化，大大提高定量分析的準確度和靈敏度。基于二階變換的HPLC法測定丙烯酰胺的線性范圍寬泛，LOQ低至10 μg/L，加標回收率為88.3%～91.0%，明顯優于不經二階變換處理的HPLC法。該方法對儀器條件要求不高，數據處理簡便，適用于復雜體系中低濃度組分的監測分析。采用該方法對市售方便面樣品進行測定，發現丙烯酰胺含量為10～300 μg/kg，其含量小于薄脆餅干等常見的小麥粉類食品。

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Determination of Acrylamide in Foods by HPLC Based on 2-Order Transformation

Xu Liheng Wang Xiao Ye Yanfen
(College of Quality & Safety Engineering China Jiliang University, Hangzhou 310018)

To aim to the determination of the acrylamide content in foods, a determination method based on 2nd-derivative HPLC chromatogram was established in this paper. It was found that in the 2nd-derivative HPLC chromatogram of food, the peak of acrylamide was sharp and separated with neighboring peaks. The limit of quantification (LOQ) of the 2-order transformation-HPLC method for acrylamide was <10 μg/L, the standard addition recoveries was in a range of 88.3%～91.0%, the accuracy and sensitivity were superior to that of HPLC method. The instant noodle samples purchased from market were determined by this method, and the acrylamide contents in instant noodles were about 10～300 μg/kg, lower than crackers and bread crisp.

2-order transformation, HPLC, signal process, acrylamide, food

TS207.3,O657.7

A

1003-0174(2014)06-0108-04

國家質檢總局質檢公益性行業科研專項(201210016)

2013-06-19

徐立恒，女，1976年出生，副教授，有機污染物檢測與食品安全