防治花鰻鱺細菌性疾病的中西藥篩選

佟延南，王德強*，李芳遠，李忠琴

(1.海南省海洋與漁業科學院，海南?？?70100;2.集美大學水產學院，福建廈門361021)

花鰻鱺(Anguilla marmorata)為脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰻鱺總目、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬的一種，又稱鱸鰻，是世界上鰻鱺屬中分布最廣泛的一種［1］，北至韓國濟州島、東至小笠原群島、南至南太平洋的馬克薩斯群島、西至非洲東海岸的納塔爾均有分布;在我國自錢塘江至海南省各江河水系中都有分布。

花鰻鱺因其市場價格是其他鰻鱺品種的3～5倍，備受養殖者的青睞，盲目的集約化養殖和養殖環境的不斷惡化，導致近幾年花鰻鱺養殖病害頻繁發生，經濟損失慘重。以往關于花鰻鱺的研究集中在其分類、地理分布、生活習性、資源調查等方面［2-6］，而在花鰻鱺病害防治藥物的研究上極少。筆者以自主分離的花鰻鱺致病菌為研究基礎，選擇4種中藥和3種西藥采用瓊脂平板稀釋法，針對分離的3株花鰻鱺致病菌進行體外抑菌試驗，以期為養殖戶提供科學、有效的病害防治理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 患病鰻鱺采至海南省?？谑写笾缕禄狑~養殖場，從其內臟(肝臟、腎臟、脾臟等)器官分離、純化到3株病原菌，由廈門市集美大學水產學院協助，通過生理生化和基因鑒定，3株病原菌分別確定為遲鈍愛德華氏菌(Sh1)、嗜水氣單胞菌(L2b)、威隆氣單胞菌(L2s)。

1.2 試驗藥材 中藥:虎杖(Rhizoma polygoni Cuspidati，簡稱 RPC);大黃(Rheum palmatum Linn.，簡稱RPL);五倍子(Rhus chinensis Mill.，簡 稱 RCM);黃 連 (Coptis chinensis Franch，簡稱 CCF)。

西藥:氟苯尼考(Florfenicol)、阿莫西林(Amoxicillin)、強力霉素(Doxycycline hyclate tablets)。

1.3 中藥加工 首先，用中藥粉碎機粉碎至100目左右，然后放入超微粉碎機進一步粉碎，收集超微藥粉備用。在掃描電子顯微鏡下觀察，90%以上的顆粒粒徑大小為5～10μm。

1.4 菌懸液的制備 將保種的菌液接種于瓊脂平板上，置于28℃恒溫培養箱內培養20～24 h;挑取單個菌落劃線至新鮮斜面上，28℃下培養20～24 h后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來，使用濁度儀將菌液濃度稀釋至107CFU/ml，即可作為藥敏試驗接種的菌懸液。

1.5 中草藥抑菌試驗 采用瓊脂稀釋法［7］，以中草藥為溶質，以營養瓊脂培養基為溶劑，配制出2倍濃度梯度的藥敏培養基(除五倍子的稀釋梯度為 0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 和0.007 812 5 mg/L;其他3 種中草藥的稀釋梯度為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg/L)。藥敏培養基均經過高壓滅菌后倒平板，取已調好濃度的菌液2μl接種在含藥平板上，每個藥物梯度做3組平行試驗。將接種好的平板放置28℃培養箱培養24和48 h。

1.6 西藥抑菌試驗 首先用無菌水配置1 mg/ml西藥母液，然后以高壓滅菌后的營養瓊脂培養基為溶劑，采用二倍稀釋法配制不同濃度梯度的藥敏培養基(濃度梯度為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 和0.05 μg/L)。取已配制的菌液2μl接種在含藥平板上，每個藥物梯度做3組平行試驗。將接種好的平板放置28℃培養箱培養24和48 h。

1.7 結果觀察 以24 h無菌落形成的最低濃度為中藥對該菌株的最低抑菌濃度(MIC)，以48 h藥板上無菌落形成的最低濃度為中藥對該菌株的最低殺菌濃度(MBC)。只有2個平行組的MIC值或MBC值一致時，才能界定為抑菌(殺菌)濃度，否則需要進行重復試驗。

2 結果與分析

2.1 中草藥對3株病原菌的抑制作用 比較了4種中藥對養殖花鰻鱺3株病原菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。由表1可知，五倍子、大黃、黃連、虎杖對3株致病菌均具有一定的抑制效果，且MIC值和MBC值相等或呈雙倍關系。其中，4種中草藥對Sh1菌株的MIC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖;4種中草藥對Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖，五倍子和黃連的MIC值和MBC值相同，大黃和虎杖的MBC值是MIC值的2倍。4種中草藥對L2b菌株的MIC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖;4種中草藥對Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖，五倍子、黃連和虎杖的MIC值和MBC值相同，大黃的MBC值是MIC值的2倍。4種中草藥對L2s菌株的MIC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖;4種中草藥對Sh1菌株的MBC值:五倍子＜大黃＜黃連＜虎杖，五倍子、大黃和黃連的MIC值和MBC值相同，而虎杖的MBC值是MIC值的2倍。

表1 不同中草藥3株病原菌的MIC和MBC mg/ml

2.2 西藥對3株病原菌的抑制作用 比較了3種西藥對養殖花鰻鱺3株病原菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。由表2可知，氟苯尼考、阿莫西林和強力霉素對3株致病菌均有良好的抗菌活性，其中強力霉素對Sh1菌株的MIC值最小，達到0.2μg/ml;其次是氟苯尼考、阿莫西林，對Sh1菌株的MIC值分別達到0.8和6.4μg/ml;阿莫西林和強力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值為25.6μg/ml。氟苯尼考對L2b菌株的MIC值最小，小于0.05μg/ml;其次是強力霉素、阿莫西林，對L2b菌株的MIC值分別為0.2和6.4 μg/ml;阿莫西林和強力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值與MIC值均小于0.05μg/ml。氟苯尼考對L2s菌株的MIC值最小，小于0.05μg/ml，其次是強力霉素、阿莫西林，對L2b菌株的MIC值分別為0.8和3.2μg/ml;阿莫西林和強力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值與MIC值均小于0.05 μg/ml。

表2 不同西藥對3株病原菌的MIC和MBC μg/ml

3 討論與結論

3.1 中藥對3株花鰻鱺病原菌的抑制作用 中草藥具有天然性、營養性、毒副作用小、無抗藥性等優點［8-9］，其在水產養殖中的主要作用包括:防治疾病、增強免疫力;促進生長，提高飼料利用率;提高存活率;減少應激作用，增加動物的耐受力等作用［10-12］。筆者研究了4種中草藥對3株花鰻鱺致病菌的MIC值和MBC值，其平均MIC值大小依次為虎杖＞黃連＞大黃＞五倍子，平均MBC值大小依次為虎杖＞黃連＞大黃＞五倍子。不同中草藥對同一菌株的抑制效果不同，其原因可能是不同中藥草其抑菌成分不同，如五倍子的主要抑菌成分為丙酮提取物［13］;而黃連的主要抑菌成分為小檗堿［14］。另外，各試驗組中有些菌株的MIC值和MBC值略有不同，說明中草藥作用于該菌株時，其抑菌濃度和殺菌濃度不同，為今后生產與應用提供理論依據。

3.2 西藥對3株花鰻鱺病原菌的抑制作用 臨床實踐表明，抗菌西藥對各種細菌性疾病均有良好的療效。該研究中3種抗菌西藥對3株花鰻鱺病原菌均具有較好的殺菌、抑菌效果，其平均MIC值大小依次為阿莫西林＞強力霉素＞氟苯尼考，平均MBC值大小依次為阿莫西林＞強力霉素＞氟苯尼考。但是，同種抗菌藥對不同菌株抑菌效果有所差異，氟苯尼考對Sh1抑制效果最差(MIC值為0.8μg/ml)，強力霉素對L2s抑制效果最差(MIC值為0.8μg/ml)，而阿莫西林則對Sh1和L2b抑制效果最差(MIC值為6.4μg/ml)。

該研究中4種中草藥和3種西藥對花鰻鱺致病菌均有不同程度的抑菌、殺菌效果，但因抗生素經常導致耐藥菌株的產生和水產品藥物殘留等問題［15］，建議在生產實踐中多使用中草藥或中西藥聯用，而中西藥聯用配伍比例有待下一步研究。

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