紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬大葉性肺炎的病理學(xué)觀察

呂 微，王先哲，陳瑩瑩，崔成都，婁安鋼*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133000;2.吉林省龍井市畜牧業(yè)管理局，吉林龍井133400)

大葉性肺炎(Lobar pneumonia)是以肺泡內(nèi)滲出大量纖維素為特征的急性炎癥，通常又稱為纖維素性肺炎。此型肺炎常侵犯一個大葉、一側(cè)肺臟或全肺，肺組織發(fā)生大面積廣泛實變?yōu)槠涮攸c［1］。

大葉性肺炎根據(jù)其病變特點通常分為4期，各期變化是這個連續(xù)發(fā)展過程的不同階段:①充血水腫期:大葉性肺炎的初期，發(fā)病第1～2天的變化，主要以肺泡毛細(xì)血管充血和漿液性水腫為其病變特點。臨床上此期病變較輕，除一些特急性豬肺疫病例外，患畜很少死亡;②紅色肝變期:由充血水腫期發(fā)展而來，一般發(fā)病第2～3天進(jìn)入此期，其病變特點是肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)有大量纖維素、紅細(xì)胞滲出。臨床上此期可發(fā)現(xiàn)病畜粘膜發(fā)紺，呼吸困難，部分病畜可見到鐵銹色鼻液及胸部疼痛的臨床癥狀;③灰色肝變期:是紅色肝變期的繼續(xù)，通常發(fā)病后第5～6天進(jìn)入此期，此期的病變特點是:肺泡壁毛細(xì)血管呈貧血狀，支氣管腔和肺泡腔中纖維。流入左心。因此，動物常常因缺氧、呼吸困難而死亡［1－4］。

實驗動物紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬是由2012年延邊大學(xué)轉(zhuǎn)基因動物與胚胎工程研究所，以反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的帶有紅色熒光蛋白(RFP)基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植的核供體，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)克隆出紅色熒光蛋白克隆胚胎，并移植于受體而生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因動物。該豬飼養(yǎng)于延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院養(yǎng)豬場，死亡前1周該豬開始病豬體溫升高，呈稽留熱型，食欲減退，精神萎頓，行動遲緩，肌肉顫栗，呼吸急促而費力，鼻流鐵銹色鼻液，臨床采用抗生素治療3 d，治療無效于2013年3月5日死亡。為了確診其死亡原因，筆者采用病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)方法，對其進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以期為臨床提供病理學(xué)的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由延邊大學(xué)轉(zhuǎn)基因動物與胚胎工程研究所提供的1只患病死亡紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬。

1.2 試驗方法

1.2.1 病理解剖學(xué)方法。在肉眼檢查紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬尸體外部狀況的基礎(chǔ)上，借助解剖刀、鑷子、剪刀等解剖器械，檢查肝、脾、腎、心、肺、子宮、輸卵管、胰腺、腎上腺等器官并切取組織固定，用于病理組織學(xué)檢查。

1.2.2 病理組織學(xué)檢查方法。固定組織通過水洗、脫水、石蠟包埋等過程制作石蠟組織切片，進(jìn)行常規(guī)染色后于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理解剖學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 體表。病豬尸體營養(yǎng)狀況不良，鼻唇發(fā)紺，鼻腔內(nèi)可見鐵銹色鼻液，體表皮膚呈淡紅色，尤其腹部和四肢末端更明顯(圖1)。

2.1.2 器官病理變化。

2.1.2.1 肺臟。肺腫脹，充滿整個胸腔，表面被覆絮狀分泌物，呈灰紅色，局部可見出血斑，質(zhì)硬如肝，間質(zhì)增寬，按壓時有大量泡沫狀液體，水中完全下沉(圖2a)。

圖1 紅色熒光克隆五指山豬的側(cè)面觀

2.1.2.2 心臟。心臟表面變化不明顯，局部組織呈鮮紅色(圖2b)。

2.1.2.3 肝臟。肝臟呈暗紅色，膽囊腫大(圖2c)。

2.1.2.4 子宮。子宮顏色呈暗紅、淤血、血管腫脹，整體顏色發(fā)紅(圖2d)。

2.1.2.5 腎臟。腎臟外表有液體流出，腎顏色呈暗紅色沒有肝表現(xiàn)明顯，有輕微淤血(圖2e)。

2.1.2.6 腹腔內(nèi)各器官。膽囊腫脹，肝臟呈暗紅，腸管內(nèi)充氣，胰腺顏色發(fā)紅，子宮、腸管和胃均為淡紅色，顏色比較明顯，表現(xiàn)出了紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬的紅色熒光蛋白基因表達(dá)(圖2f)。

圖2 紅色熒光克隆五指山豬的器官病理變化

2.2 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 肺臟。肺泡腔和支氣管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞侵潤，支氣管上皮脫落，周邊出血、充血，氣管腺有大量炎性細(xì)胞侵潤。肺部肺泡隔毛細(xì)血管高度擴(kuò)張充血，而另一部分充血消失，只見大量炎性細(xì)胞，這種表現(xiàn)明顯處于紅色肝變期和灰色肝變期之間(圖3a～d)。

2.2.2 胰腺。胰腺細(xì)胞壞死，細(xì)胞漿凝固，紅染，胞漿發(fā)紅，組織結(jié)構(gòu)可以辨認(rèn)，但壞死細(xì)胞呈多種變化(圖3e)。

2.2.3 肝臟。肝臟嚴(yán)重淤血，肝竇擴(kuò)張，充滿了紅細(xì)胞，肝索排列紊亂，胞漿顏色上與正常豬相比有很大差異，體現(xiàn)出紅色熒光蛋白在其中有表達(dá)作用(圖3f)。

2.2.4 子宮。子宮有淤血，無其他癥狀，顏色與正常豬對比組織顏色發(fā)紅(圖3g)。

3 討論與結(jié)論

大葉性肺炎早期肺臟略增大，有一定彈性，病變部位肺組織呈褐紅色，切面光澤而濕潤，按壓流出大量血樣泡沫，切面光澤而濕潤，按壓流出大量血樣泡沫。一般紅色肝樣變期可見受累肺葉腫大，質(zhì)地變實，切面灰紅色，較粗糙，胸膜表面可見纖維素性滲出物［1］。顯微鏡下，肺泡壁毛細(xì)血管仍擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)充滿含大量紅細(xì)胞、一定量纖維素、少量嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的滲出物。灰色肝變期肉眼可見肺葉腫脹，質(zhì)實如肝，切面干燥粗糙，肺泡腔內(nèi)的紅細(xì)胞大部分溶解消失，而纖維素滲出顯著增多，因此實變區(qū)呈灰白色。顯微鏡下，肺泡腔滲出物以纖維素為主，纖維素網(wǎng)中見大量嗜中性粒細(xì)胞，紅細(xì)胞較少。

此次觀察發(fā)現(xiàn)病豬生前體溫升高，呈稽留熱型，食欲減退，精神萎頓，行動遲緩，肌肉顫栗，呼吸急促而費力，病豬尸體營養(yǎng)狀況不良，鼻唇發(fā)紺，流鐵銹色鼻液、膽囊腫脹，肝臟呈暗紅，腸管內(nèi)充氣，肺葉腫脹，重量增加，間質(zhì)增寬，表面被覆一薄層纖維素性滲出物。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)病變肺葉仍腫脹，呈灰白色，質(zhì)實如肝，顯微鏡下可見各組織均有淤血和充血現(xiàn)象而肺部肺泡腔內(nèi)滲出物繼續(xù)增加，充滿中性粒細(xì)胞和纖維素，肺泡壁毛細(xì)血管受壓，肺組織呈貧血狀。肺泡腔和支氣管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞，支氣管上皮脫落，周邊出血充血，氣管腺內(nèi)有大量炎性細(xì)胞，肺部肺泡隔毛細(xì)血管高度擴(kuò)張充血，而另一部分充血消失，因此處于紅色肝樣變和灰色肝樣變之間。經(jīng)初步確診，確定五指山豬死亡的主要原因是由于非傳染性大葉性肺炎導(dǎo)致呼吸困難而致機(jī)體缺氧死亡。

圖3 紅色熒光克隆五指山豬的病理組織學(xué)變化

轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)的研究可為實現(xiàn)快速目標(biāo)育種、改善人類異種器官移植供體器官的來源、生產(chǎn)特定人類疾病模型豬等工作提供重要基礎(chǔ)。該研究對我國體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因豬的研究具有重要的參考價值。通過綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物的研究可以為其他各類具有重要應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因動物的研究提供良好的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。以核移植技術(shù)路線最早出生的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬是2002年由美國的一個實驗室完成的，此后相繼有不同實驗室獲得了綠色熒光轉(zhuǎn)基因豬［5］。國內(nèi)也有關(guān)于紅色熒光轉(zhuǎn)基因豬的相關(guān)報道，研究獲得了4頭以核移植技術(shù)路線制作的紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬，其中2頭已經(jīng)健康生長，各發(fā)育指標(biāo)均表現(xiàn)正常。該結(jié)果表明目前已經(jīng)具備采用體細(xì)胞核移植技術(shù)路線制作轉(zhuǎn)基因豬的全部技術(shù)，為下一步實現(xiàn)人類疾病模型轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因育種等具有重要應(yīng)用價值的研究工作打下了良好的基礎(chǔ)。

該試驗以紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬為實驗動物具有重要的科學(xué)實驗意義。對于出生后死亡的個體，分別取心臟、肺臟、腎臟、脾臟、等組織，在熒光檢測下紅色熒光蛋白表達(dá)情況與正常豬相比表現(xiàn)非常明顯，各組織熒光蛋白均在其中有表達(dá)，但表達(dá)效果完全不一。紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬皮膚及各臟器均呈紅色，顏色深淺因不同器官而有差異。今后應(yīng)該進(jìn)一步研究更好的試驗方法予以證實。

［1］趙德明.獸醫(yī)病理學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2012.

［2］金勝柱，潘振華，張寶玉，等.豬纖維素性肺炎的病理分析與診治［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007(6):65.

［3］THIAUCOURT F，BOLSKE G.Contagious caprine pleuropneumonia and other pulmonary mycoplasmases of sheep and goats［J］.Rev Sci Tech，1996，15(4):1397 －1414.

［4］WESONGA H O，BLOSKE G，THIAUCOUNT F，et al.Experimental contagious caprine pleuropneumonia:alongtermstudy on thecourseof infection and pathology in a flock of goats infected with Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae［J］.Acta Vet Scand，2004，45(3/4):167 －179.

［5］KANGJD，YIN X J，ZHAOM H，et al.production of trans genic pig clone embryo expressed the red fluorescent proteinby using the somatic cell nucleus transpl－ antation technology［J］.Agricultura Science and Technology，2011，12(2):287 －290，307.