BHK21細胞的懸浮馴化及其懸浮培養參數研究

田 波，尚勇良，武發菊，安芳蘭，萬玉林，劉學榮*，楊進才

(1.甘肅農業大學，甘肅蘭州730000;2.中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046)

隨著獸用生物制品產業的發展，近年來動物細胞培養成為國內外研究的熱點。BHK21細胞作為WHO推薦的生產獸用疫苗細胞，現已在規?；a中用懸浮培養的模式在應用。目前人們為適應特定工業化的需要，通過改變細胞的生長方式和生活環境，對工程細胞進行貼壁―懸浮的馴化。貼壁培養細胞經過懸浮馴化可以轉變為懸浮生長株［1－2］，或添加抗剪切保護劑進行規?；瘧腋∨囵B。懸浮馴化過程中細胞易粘附聚集及結團是目前貼壁細胞進行懸浮培養常見的問題［3－4］。由于動物細胞在懸浮培養條件下對生長環境、培養基的要求十分嚴格，優化BHK21細胞的懸浮培養條件，使之達到最佳生長狀態，從而為體外規模化細胞培養平臺奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 中農威特生物科技服務有限公司研發部保存的BHK-21細胞，購自ECACC，貨號:84111301，來源:Hamster Syrian Kidney，產品編號:05K029，代次:10代。培養基為自制的MEM+7%的胎牛血清，使用前按照產品說明書配制。新生牛血清購自蘭州榮曄生物技術有限責任公司。胰酶購自HyClone公司。碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸等常用試劑為國產分析純。

1.2 主要儀器 細胞計數儀，德國INNOVATIS公司;滲透壓測定儀，上海醫科大學儀器;T25、T75培養瓶，1 000 ml三角培養瓶購自Nunc公司;5 L生物反應器，BELLCO生物反應器，7.5 L生物反應器，美國NBS公司。

1.3 方法

1.3.1 BHK-21細胞的懸浮馴化。取BHK21貼壁細胞種子，在T75培養瓶中加入新鮮培養基進行復蘇培養，接種比例為1∶3，待細胞長滿單層并生長良好時，胰酶消化，用移液管輕輕吹打成單細胞懸浮液，以0.75×106個/ml密度接種至1 000 ml三角培養瓶中，在37℃、100 r/min下先攪拌培養。并依此法連續傳代，直至40代，培養過程中對每代細胞取樣計數并觀察細胞形態。

1.3.2 血清含量對懸浮培養細胞的影響。在其他培養條件一致的條件下，將已馴化的懸浮細胞種子傳代擴大培養，并以0.5×106個/ml的細胞密度接種至5 L生物反應器培養。培養過程中將GMEM培養基中的血清含量分別調整為1%、2%、5%、8%、15%和20%6個濃度進行培養，培養過程中對每代細胞取樣計數并觀察細胞形態。

1.3.3 培養液pH對懸浮培養細胞的影響。在其他培養條件一致的條件下，將GMEM培養液的pH分別設置為6.8～7.0、7.0 ～7.2、7.3 ～7.5 和 7.6 ～7.8，37 ℃ 培養 48 h 后，取樣計數并觀察細胞形態。

1.3.4 溶解氧對懸浮培養細胞的影響。培養條件同“1.3.3”，以不同轉速及通氣方式進行懸浮培養，第1種:80 r/min，1孔通氣;第 2種:80 r/min，2孔通氣;第 3種:120 r/min，2孔通氣。均在37℃培養48 h后，取樣計數并觀察細胞形態。

1.3.5 全自動冰點滲透壓計測定滲透壓。①開機，待顯示溫度降至－9℃按“↑”鍵使測量探頭升起;②輕輕沖洗探頭，并加入0.5 mI樣品于樣品管中，套緊于測量探頭上，按“↑”測量開始;③約5 min測量探頭升起，得出測量結果;④記錄結果，取下樣品管，并按“↑”鍵使探頭回落，最后關機。

1.3.6 細胞培養形態觀察及細胞數目和活力的測定。將取出的細胞懸浮液直接滴在載玻片上在顯微鏡下觀察;用細胞分析儀計數細胞，分析細胞活力。

2 結果與分析

2.1 BHK21細胞懸浮馴化培養過程中細胞結團的研究

2.1.1 BHK21細胞懸浮馴化培養過程中細胞形態變化的比較。BHK21細胞在GMEM培養基中生長形態的變化圖1。在培養初期(圖1a、1b)，大多數細胞散在分布，單個細胞透亮，邊緣光滑，部分細胞呈花生狀分布;隨著培養時間的延長，細胞逐漸相互粘附，2～3個細胞或更多聚集在一起(圖1c、1d)，細胞結團越為明顯，更多的細胞粘連，團塊變大，但很松散，輕輕吹打細胞，結團即消失，此時結團的細胞在鏡下觀察仍很透亮，活性好;由于細胞結團給物質的傳遞帶來極為不利的影響，在細胞培養11 d后(圖1e)，細胞邊緣不光滑，細胞體積增大，細胞結團越來越致密，團塊內細胞已無明顯輪廓界限，不能吹散;在培養后期(圖1f)，大量細胞開始死亡，結團逐漸消失。

圖1 BHK21細胞懸浮馴化培養過程中細胞形態的變化

2.1.2 BHK21細胞馴化培養過程中細胞結團對生長狀態的影響。由表1可知，隨著培養時間的變化，細胞結團平均粒徑、細胞的生長活性和平均比生長速率受到一定的影響。在培養初期，細胞結團的平均粒徑較小，在12.81～15.78μm，細胞活性最高，從比生長速率反映出細胞生長速度較快，細胞生長代謝旺盛;在培養至第8天，隨著細胞結團數量的增多，結團平均粒徑增加，細胞繼續保持指數生長期，平均比生長速率達到了最大值2.93，細胞活性在94%左右，此時結團的細胞在鏡下觀察更加透亮，活性更高;當培養至第11天，結團平均粒徑不再增加，細胞活性逐漸下降，比生長速率降低，細胞生長速度減緩。主要是因為在BHK21細胞懸浮馴化生長過程中，細胞結團過大，給物質傳遞帶來較大的阻力，使得團塊內的細胞營養物耗竭和代謝副產物積累，細胞生長受到影響;在培養后期，細胞結團松散，細胞活性迅速下降，細胞逐漸崩解。

因此，細胞的結團嚴重影響了細胞的生長代謝，在細胞培養中應通過不同方法如調節Ca2+濃度，添加肝素、EDTA等物質以避免細胞結團的出現。

表1 BHK21細胞培養過程中結團的平均粒徑與細胞生長狀態的變化

2.2 接種濃度對懸浮培養細胞的影響 BHK21細胞在不同接種濃度下培養(其他培養條件相同)，當接種濃度過低，即低于0.2×106個/ml時，細胞生長增值明顯減緩，細胞濃度的倍增時間由24 h延長至48 h或更多;若接種濃度過高，即1.0×106個/ml時，在培養期間細胞培養液的pH下降較快，不利于BHK21細胞的生存，因而抑制了細胞的生長，細胞倍增速率降低。

2.3 血清含量對懸浮培養細胞生長的影響 BHK21細胞在不同血清濃度的培養液中生長(其他培養條件相同)，含15%和20%高濃度血清的培養液可使細胞懸浮傳代24 h后，培養液的pH快速下降，可低至6.5～6.8，顯微鏡下觀察，上清液中可見較多雜質，細胞形態一般，胞內有顆粒狀物質。為了避免細胞出現老化現象，應及時換液;當血清濃度較低時(1%、2%)，細胞生長緩慢，細胞終密度明顯低于其他組;血清濃度為5%、8%時，懸浮培養過程中細胞生長較好，與對照組相比無顯著差異。因此，綜合細胞及生產成本考慮，牛血清的最佳含量為5%。

2.4 培養液p H對懸浮培養細胞的影響 當pH7.0～7.2時，培養液的pH下降較快，細胞生長快，細胞密度比同期其他試驗組高，細胞活性也較好。當BHK21細胞培養液pH在7.4或6.8時，培養48 h后細胞生長緩慢，細胞密度顯著低于其他試驗組。所以BHK21細胞培養液理想的pH為7.0～7.2。

2.5 溶解氧對懸浮培養細胞的影響 該試驗中所用的5 L生物反應器有2個通氣孔，一孔可與空氣過濾器相連，另一孔不用時用螺帽封口，通氣時用滅菌的外有牛皮紙包被的多層紗布扎口即可。不同方式培養細胞的結果見表2，由表2可知，在2孔通氣的方式80 r/min培養，細胞團塊較多，細胞貼覆在罐壁和罐底的情況較多，而采用2孔通氣的100 r/min有利于BHK21細胞的生長。

表2 不同轉速與通氣量對細胞生長的影響

3 結論與討論

(1)在貼壁細胞懸浮馴化培養中，細胞聚集成團是影響細胞生長的最大障礙。當細胞狀態不好時，細胞團塊直徑可達數毫米，粘附的細胞數目達103個以上。由于細胞的成團聚集給物質傳遞帶來的巨大阻力，使得陷于細胞團中央的細胞得不到充足的營養，細胞由于營養物質的缺乏，細胞活性和生長速率逐漸降低，細胞開始凋亡。隨著細胞粘附基質的改變，凋亡發生率增加，從而引起細胞蛋白結構改變等一系列問題，使得細胞表達能力下降［5］。可見，細胞結團對細胞生長狀態具有嚴重的影響，其影響程度的大小取決于細胞團塊的疏松度和細胞結團的平均粒徑大小。在該試驗中，BHK21細胞培養初期，細胞的結團粒徑逐漸增加，而細胞活性一直較高，細胞生長速度快;隨著培養時間延長，結團平均粒徑達到最大值后不再增加，且越來越致密，而細胞活性下降，細胞生長速度減慢，團塊逐漸散開，最后細胞死亡。因此，在懸浮細胞培養研究中，通過調控細胞結團尺寸的大小或消除細胞結團可提高細胞活性和培養密度，能改善細胞生長狀態，最終提高目標產品產量。

(2)懸浮培養馴化試驗發現，當細胞接種濃度過低時，由于細胞間的相互作用及所分泌的各種細胞生長因子降低，使得細胞生長緩慢;當細胞接種濃度過高時，由于營養物質的快速消耗及代謝副產物積累較多等原因，使得細胞生長緩慢，比生長速率低于正常值。

(3)血清的質量和濃度對細胞培養有直接的影響［6］。一般透明、淡黃色，加熱滅活后顏色較深，蛋白沉淀少為優良的血清。在細胞培養中，所用血清應進行無支原體和病毒污染以及無其他微生物污染的檢測，及細胞生物學方面的檢測。將所用的血清連續傳代3次以上培養細胞，確定它是否適宜該細胞系的長期生長［7］。該試驗結果表明，血清濃度越高，細胞分化速度越快，細胞生長較快，隨著細胞代謝物的增多及其血清中一些抑制因子作用的加強，細胞生長減慢，同時細胞形態也受到影響。目前由于血清來源不穩定且價格昂貴、作用機制不明確及實驗和生產的標準化困難等一系列原因，使得開發出經濟適用的血清替代品和無血清培養基成為亟待解決的難題。

(4)大規模培養時，影響培養液pH穩定性的主要因素有:①緩沖液的緩沖能力及種類;②對流空間大小;③葡萄糖濃度。培養液中正常的緩沖系統是NaHCO3/CO2系統。它是一種弱緩沖系統，其pKa為6.1，低于生理學最佳要求。這種緩沖系統要求在培養液上面的對流空間加入CO2以防止其丟失及增加羥基離子。也有人使用磷酸緩沖液，但有資料報道磷酸對動物細胞有毒害作用。該試驗未做該方面的嘗試。另外HEPES生物緩沖劑也可加入NaHCO3/CO2系統，其 pKa為7.0，其緩沖能力為 pH 6.8 ～7.2。但當 HEPES 濃度高于25 mmol/L時，他對大多數動物細胞也有毒害作用。在細胞懸浮培養過程中，由于營養物質的消耗和代謝副產物積累使得培養液的pH下降較快，從而抑制了細胞的生長。通常，大多數細胞的最適生長環境pH在7.0左右，當pH下降至6.8時，會抑制細胞的生長，因此必須對PH進行調控，使培養過程中pH不能下降至6.8以下。

(5)在動物細胞大規模培養時，如何提供足夠的氧非常重要［8］。同期攪拌的目的主要有:①提供細胞代謝所需的足夠氧氣;②使培養液處于均勻懸浮狀態，有利于傳質過程。對于一定的設備而言，增大攪拌速度、攪拌功率和通氣量都能提高溶氧水平，但三者之間相互關聯。

［1］魏明旺，張淑香.動物細胞大規模培養的主流技術［J］.生物產業技術，2009，4(7):85 －89.

［2］ZHOU JX，TRESSEL T，YANG X M，et al.Implementation of Advanced Technologies in Commercial Monoclonal Antibody Production［J］.Biotechnol J，2008，3:1185 －1200.

［3］RORY M.Adaptation of Chinese Hamster Ovary cells in culture:a literature survey of adhesion proteins［R］.Individual Inquiry A，2002:2 －3.

［4］HUWS，AUNINSJG.Large-scalemammalian cell culture［J］.Current O-pinion in Biotechnology，1997(8):148 －153.

［5］陳因良，陳志宏.細胞培養工程［M］.上海:華東化工學院出版社，1992.

［6］HU WS，AUNINSJG.Large-scale mammalian cell culture［J］.Curropin Biotech，1997，8:148.

［7］KALLOS M S，BHEIE L A，VESEOVI A.Extended serial Passaging of mammalina neural stem Cells in suspension bioreaetors［J］.Bioteehnol Bioeng，1999，65(5):589 －599.

［8］CHU C，LUGOVTSEV V，GOLDING H，et al.Conversion of MDCK Cell Line to Suspension Culture by Transfecting with Human Gene and Its Application for Influenza Virus Production［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(35):14802 －14807.