黑毛茶中產單寧酶真菌的篩選及產酶條件研究

鄭重誼，王嬌嬌，資 云，張冬雪，周 輝

（1.湖南農業大學研究生院，湖南長沙410128；2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128）

湖南黑茶是以湖南黑毛茶（老青茶）為原料蒸壓成形的緊壓茶的總稱，它的加工包括殺青、揉捻、渥堆、干燥等多道工序，其中渥堆是關鍵工序［1］，通過霉菌、酵母、細菌等微生物的發酵［2］，形成黑毛茶的獨特風味［3］。溫瓊英等［4］研究發現，真菌數量隨渥堆時間的延長遞增。董坤等［5］研究發現，以曲霉為主的霉菌和以產酒精和酯等生香酵母為主的酵母菌是普洱茶渥堆過程中的優勢菌種。黑曲霉能降解單寧，產生沒食子酸［6－7］，使普洱茶形成深紅色的湯色［8］。黑茶中的另一種真菌冠突散囊菌能產生各種胞外酶，促進催化氧化、聚合、降解、轉化等反應，改善茶的品質［9］，并且該真菌能在單寧為唯一碳源的培養基中生長，具有降解單寧的能力，能降低茶葉苦澀味，使茶葉滋味醇和［10］。

單寧酶，又叫單寧酯酰水解酶，可以水解沒食子酸丙酯而生成沒食子酸，是目前唯一能將茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯轉化為表沒食子兒茶素的酶［11－12］，在茶多酚單體的制備上具有重要作用。雖然單寧酶在食品、飼料、醫藥等行業都有著廣泛的應用，但生產成本較高，極大地限制了單寧酶的應用。微生物源單寧酶屬于誘導酶，在制備過程中往往需要加入單寧酸或富含單寧酸的物質（如五倍子渣）。若利用五倍子渣作為基質直接進行固態發酵，不僅可以提高五倍子中單寧酸的提取效率，還可以拓寬單寧酶的來源渠道。

作者在此對湖南益陽安化黑茶產區黑毛茶渥堆過程中產單寧酶真菌進行篩選和初步鑒定，并對其產單寧酶條件進行優化。擬為開發利用黑毛茶渥堆過程中的微生物資源、深入了解渥堆過程中微生物的作用機制提供參考。

1 實驗

1.1 材料與培養基

黑毛茶樣品，取自湖南益陽安化縣某黑茶廠渥堆階段，裝入采集袋中，4 ℃保存，備用。

馬鈴薯培養基（PDA）：將馬鈴薯去皮切塊，稱取300g，加水1 000mL，煮沸10～20 min，雙層紗布過濾，取濾液，用水補足至1 000mL，加葡萄糖20g、瓊脂20g，自然pH 值，于121 ℃下高壓滅菌20min。

篩選培養基：蔗糖1.0%，NaNO30.3%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO40.001%，單寧酸2%，自然pH 值。

發酵培養基：稱取提取單寧酸后的五倍子渣及麩皮的混合物共5g，裝入250 mL 三角瓶中，加無機鹽溶液5 mL。無機鹽溶液組分為：NH4NO30.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.1%。

1.2 方法

1.2.1 產單寧酶真菌的篩選

稱取25g黑毛茶樣品，置于225mL 無菌生理鹽水中，10倍梯度稀釋后，吸取100μL 稀釋液，涂布在添加了單寧酸及指示劑溴酚蘭（0.004%）的篩選培養基上，于28℃培養5d（產單寧酶真菌的生長會使培養基由藍色變為黃色，從而形成變色圈），挑取菌落較大且變色圈直徑較大的菌落至無菌的PDA 培養基中，培養一定時間，取孢子進行梯度稀釋，從平板上挑取單菌落進行純化，保存。對變色圈較大的真菌進行鏡檢，初步鑒定其歸屬。將產酶活性最高的菌株編號為WC－2。

1.2.2 孢子懸浮液的制備

首先將菌株WC－2在PDA 斜面上進行活化培養，接著取28 ℃培養5d的新鮮斜面若干支，每支加入5 mL無菌生理鹽水，用無菌接種環將斜面上的孢子刮下來，將孢子懸浮液移入滅菌的空三角瓶中，振蕩搖勻。以上操作均在無菌臺中進行，孢子懸浮液中的孢子數量可利用PDA 平板計數。

1.2.3 固態發酵制備單寧酶

在發酵培養基中加入1 mL 孢子懸浮液，充分振蕩使孢子與培養基混合均勻后，于28℃恒溫培養箱中培養96h。

1.2.4 粗酶液的提取

從培養箱中取出發酵后的固態基質，加入50mL pH 值為5.0的檸檬酸緩沖溶液，于160r·min－1搖床振蕩30min，過濾，即得粗酶液。

1.2.5 單寧酶活力的測定

根據單寧酶水解沒食子酸丙酯可產生沒食子酸，沒食子酸與甲醇繞單寧溶液在堿性條件下形成的色團物質在520nm 處具有最大吸收的原理進行測定［13］。

酶活力單位定義為：在30 ℃下，每分鐘分解產生1μmol沒食子酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.6 發酵溫度對產單寧酶的影響

在發酵培養基中接種WC－2孢子懸浮液后，放入溫度分別為25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃的培養箱中培養96h后提取單寧酶并測定酶活力，考察發酵溫度對菌株WC－2產單寧酶的影響。

1.2.7 發酵時間對產單寧酶的影響

在發酵培養基中接種WC－2 孢子懸浮液后，于28 ℃培養箱中培養，每隔24h 測定單寧酶活力。以發酵時間為橫坐標、單寧酶活力為縱坐標繪制菌株產酶曲線，研究酶活力變化情況。

1.2.8 發酵培養基成分對產單寧酶的影響

分別考察發酵培養基中五倍子渣含量（固形物含量，質量分數，20%、40%、60%、80%）、外加氮源（0.5%的蛋白胨、檸檬酸銨、酵母浸膏、硫酸銨、氯化銨、亞硝酸銨、硝酸銨）、外加碳源（1%的葡萄糖、甘露糖、D－果糖、蔗糖、甘油、α－乳糖）對WC－2菌株產單寧酶的影響：在發酵培養基中接種WC－2孢子懸浮液，于28 ℃培養96h，測定單寧酶活力。

2 結果與討論

2.1 產單寧酶真菌的篩選

以單寧酸為唯一碳源，從渥堆的黑毛茶中篩選得到5株具有分泌單寧酶活性的真菌（圖1），分別編號為WC－1～WC－5，其中菌株WC－2的產酶活性最高，經菌絲體染色鏡檢，初步鑒定為黑曲霉。

圖1 產單寧酶真菌的篩選Fig.1 Screening of tannase－producing fungi

目前報道較多的產單寧酶真菌主要來自于黑曲霉，而黑毛茶在渥堆過程中的主要優勢真菌就包括黑曲霉。所以，從黑毛茶中分離出產單寧酶的黑曲霉進一步驗證了黑曲霉不僅參與黑毛茶的渥堆過程，還可能參與化學物質的轉化和形成。

2.2 發酵條件及發酵培養基組成優化

2.2.1 發酵溫度對產單寧酶的影響（圖2）

圖2 發酵溫度對產單寧酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on tannase－producing

由圖2可看出，菌株WC－2在37 ℃固態發酵下產生的單寧酶活力最強。這與已報道過的黑曲霉產單寧酶最佳溫度不一致，可能與該菌株的生長環境有關。因為，在黑毛茶渥堆過程中的溫度往往會超過50 ℃，使得耐高溫真菌得以存活和生長。因此，選擇最佳發酵溫度為37 ℃。

2.2.2 發酵時間對產單寧酶的影響（圖3）

圖3 發酵時間對產單寧酶的影響Fig.3 Effect of fermentation time on tannase－producing

由圖3可看出，單寧酶的活力隨發酵時間的延長先上升后下降，在72h時單寧酶的活力達到最高，為11.64U·g－1。這是因為，單寧酶的合成和分泌一般在黑曲霉生長最旺盛的階段（即發酵72～120h），隨后單寧酶合成會減弱，并被蛋白酶所降解。因此，選擇最佳發酵時間為72h。

2.2.3 五倍子渣含量對產單寧酶的影響（圖4）

圖4 五倍子渣含量對產單寧酶的影響Fig.4 Effect of dallnut dregs content on tannase－producing

由圖4可看出，隨著發酵培養基中五倍子渣含量的增加，單寧酶活力逐漸升高，在含量為80%時，酶活力最高達到13.92U·g－1。實驗發現，在五倍子渣含量超過80%后，發酵培養基在高溫滅菌后容易發生結塊，不適于固態發酵。因此，選擇發酵培養基中的五倍子渣最佳含量為80%。

2.2.4 外加氮源對產單寧酶的影響（圖5）

由圖5可看出，發酵培養基中添加無機氮源有利于單寧酶的產生，其中以硝酸銨為外加氮源時所產單寧酶活力達到19.65U·g－1。因此，選擇最佳外加氮源為硝酸銨，添加量為0.5%。

2.2.5 外加碳源對產單寧酶的影響（圖6）

由圖6可看出，添加不同碳源時，單寧酶的活力大小依次為α－乳糖＞甘露糖＞蔗糖＞D－果糖＞甘油＞葡萄糖，其中α－乳糖的效果最好，酶活力可達14.60U·g－1。因此，選擇最佳外加碳源為α－乳糖，添加量為1%。

在上述優化的發酵條件和發酵培養基組成下，即五倍子渣含量為80%，外加碳源為α－乳糖、添加量1%，外加氮源為硝酸銨、添加量0.5%，發酵溫度37 ℃，發酵時間72h，單寧酶活力達到27.06 U·g－1。

圖5 不同外加氮源對產單寧酶的影響Fig.5 Effect of different additional nitrogen sources on tannase－producing

圖6 不同外加碳源對產單寧酶的影響Fig.6 Effect of different additional carbon sources on tannase－producing

3 結論

采用富含單寧酸的平板培養基對黑毛茶中產單寧酶的真菌進行篩選，經純化后初步鑒定該菌為黑曲霉，并對其中一株黑曲霉WC－2產單寧酶的發酵條件以及發酵培養基的組成進行了優化。優化后的條件為：五倍子渣含量80%，外加碳源為α－乳糖、添加量1%，外加氮源為硝酸銨、添加量0.5%，發酵溫度37 ℃，發酵時間72h。在此條件下，單寧酶活力最高達到27.06 U·g－1。

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