改性秸稈載體固定化微生物修復(fù)石油污染土壤

張秀霞，武海杰，韓雨彤，郭云霞，張守娟

（中國(guó)石油大學(xué) 環(huán)境與安全工程系，山東 青島 266580）

隨著石油開采的加速，石油烴類物質(zhì)對(duì)環(huán)境的污染日益嚴(yán)重，尤其是“跑冒滴漏”引起的土壤石油污染正威脅著人們的生產(chǎn)、生活。目前，生物法是處理石油污染土壤最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一，而固定化微生物技術(shù)由于處理效率高、易保持微生物活性等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用廣泛。對(duì)于石油污染土壤的處理，固定化微生物技術(shù)明顯優(yōu)于游離微生物修復(fù)土壤的效果［1－3］；吸附法制備固定化微生物，因操作簡(jiǎn)單、細(xì)胞活性損失小而得到了廣泛應(yīng)用，但存在微生物與載體結(jié)合不牢、容易脫落以及易達(dá)到吸附飽和的缺陷。載體的比表面積和孔結(jié)構(gòu)等表面物理特性和表面化學(xué)特性影響到固定化效率［4］，通過改性可以改變載體表面官能團(tuán)的種類和數(shù)量［5］，從而改變載體的化學(xué)吸附［6］、親水性以及疏水性。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者［7－8］通過改變載體材料的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)提高載體材料的吸附性能，提高對(duì)廢水中有機(jī)物、陰陽(yáng)離子以及重金屬的去除效率，載體表面的含氧官能團(tuán)如羥基、羧基和內(nèi)酯基有利于固定微生物，提高微生物的吸附能力以及結(jié)合強(qiáng)度［9－10］。

實(shí)驗(yàn)采用硝酸、硫酸、乙酸和硼酸等對(duì)秸稈材料XMG進(jìn)行改性，以增加XMG表面酸性官能團(tuán)含量，提高載體對(duì)微生物的吸附量，再采用改性XMG吸附法制備固定化微生物，應(yīng)用于石油污染土壤的修復(fù)，考察改性XMG固定化微生物的修復(fù)效果，為石油污染土壤的生物修復(fù)提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料

供試土壤采自新疆克拉瑪依油田的風(fēng)城作業(yè)區(qū)，pH值范圍7.2～7.4，含水率范圍7%～9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍23.7～35.8g/kg，全氮量范圍14.7～19.8g/kg，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍14.9～19.8g/kg，石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍3.4%～4.7%。供試土壤去除植物殘?bào)w以及礫石過3mm篩，經(jīng)自然風(fēng)干7d后使用。

1.2 富集培養(yǎng)基

牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，pH 值7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 XMG的酸性氧化改性

分別用一定濃度硝酸、硫酸、硼酸和乙酸作為改性劑，在一定溫度下改性秸稈XMG一定時(shí)間。用蒸餾水將XMG洗至中性，烘干后用于測(cè)定XMG表面的酸性官能團(tuán)、堿性官能團(tuán)含量，用作載體材料制備固定化微生物。

1.3.2 XMG吸附微生物量的測(cè)定

采用光密度OD600間接表示XMG吸附微生物量［11］。向活化12h的50mL菌液中投加40目0.5g的XMG，在30℃、160r/min的搖床中固定微生物。12h后，將錐形瓶取出靜置一段時(shí)間倒掉上清液，用生理鹽水將XMG轉(zhuǎn)移至50mL離心管中（不晃動(dòng)），1000r/min下離心分離5min。取出后倒掉上層清液，重復(fù)3次；加入約10mL生理鹽水于離心管中（劇烈振蕩），1000r/min下離心分離5min，將上層液體過濾至50mL容量瓶，重復(fù)3次；用生理鹽水將濾液定容至50mL，搖勻，采用721分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定其OD600值。

1.3.3 XMG表面官能團(tuán)的測(cè)定方法

采用Boehm法［12］測(cè)定XMG表面羧基、內(nèi)酯基、羥基官能團(tuán)和堿性官能團(tuán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性條件對(duì)改性XMG吸菌性能的影響

2.1.1 改性劑濃度的影響

使用硝酸、硫酸、硼酸和乙酸為不同的改性劑，15℃時(shí)，分別在0、1、5、10和15mol/L濃度下，對(duì)XMG改性60min，考察改性劑濃度對(duì)改性XMG吸菌性能的影響，結(jié)果示于圖1。

圖1 改性劑濃度（c（Modifier））對(duì)改性XMG吸菌量（OD600）的影響Fig.1 The effect of modifier concentration（c（Modifier））on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由圖1可知，隨著酸濃度的增加，改性XMG的吸菌量（即OD600）呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。硝酸、硫酸、乙酸、硼酸摩爾濃度分別為5、5、10和5mol/L時(shí)，改性XMG的OD600達(dá)到最大值。

酸改性可增加秸稈表面羧基、羥基的含量，同時(shí)酸改性秸稈能夠去除秸稈表面的灰質(zhì)、中和秸稈表面堿性官能團(tuán)［13］含量，因此在一定濃度范圍內(nèi)，酸濃度越高，越有利于活性基團(tuán)的增加；同時(shí)，帶有氨基、羧基和羥基等反應(yīng)性基團(tuán)的大孔載體在固定化微生物過程中會(huì)與微生物發(fā)生鍵合，從而提高了固定化微生物的吸附量和穩(wěn)定性［14］，因此隨著酸濃度的增加，改性XMG的吸菌量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。隨著酸濃度的繼續(xù)增加，改性XMG的吸菌量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于高濃度的酸破壞了XMG原有成分，從而不利于吸附微生物［15］。

2.1.2 改性時(shí)間的影響

在室溫15℃下，分別采用5mol/L的硝酸、5mol/L的硫酸、10mol/L的乙酸和5mol/L的硼酸對(duì)XMG改性，改性時(shí)間分別為0、30、60、90、120min，考察改性時(shí)間對(duì)改性XMG吸菌性能的影響，結(jié)果示于圖2。

圖2 改性時(shí)間（t（Modification））對(duì)改性XMG吸菌量（OD600）的影響Fig.2 The effect of t（Modification）on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由圖2可知，對(duì)于4種酸改性的XMG，隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，其吸菌量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。5mol/L的硝酸、5mol/L的硫酸、10mol/L的乙酸和5mol/L的硼酸分別在改性時(shí)間為60min、60min、30min和30min時(shí)，改性XMG的吸菌量達(dá)到最大值。

秸稈材料通常具有水溶性差、反應(yīng)活性不足等缺點(diǎn)，通過適當(dāng)?shù)母男詴?huì)破壞原有的有序結(jié)構(gòu)并引進(jìn)新的功能基團(tuán)，使其反應(yīng)活性增強(qiáng)［16］。采用酸改性秸稈材料，秸稈材料表面總堿度隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，同時(shí)總酸度隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，有利于吸附固定化微生物的表面官能團(tuán)更多地暴露在表面，更容易吸附微生物［13］，因此隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，改性XMG吸菌量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；隨著改性時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，改性XMG吸菌量有降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦男詴r(shí)間過長(zhǎng)使得XMG的比表面積和孔徑發(fā)生了變化，從而不利于吸附微生物。

2.1.3 改性溫度的影響

分別在15、30、50、70和100℃下，采用5mol/L的硝酸改性60min、5mol/L的硫酸改性60min、10mol/L的乙酸改性30min和5mol/L的硼酸改性30min，考察改性溫度對(duì)改性XMG吸菌性能的影響，結(jié)果示于圖3。

圖3 改性溫度（T）對(duì)改性XMG吸菌量（OD600）的影響Fig.3 The effect of modification temperature（T）on modified XMG bacteria uptake（OD600）

由圖3可知，隨著改性溫度的升高，改性XMG吸菌量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在70℃下，5mol/L的硝酸改性60min、5mol/L的硫酸改性60min、5mol/L的硼酸改性30min及10mol/L的乙酸在30℃下改性30min時(shí)，改性XMG的吸菌量分別達(dá)到其最大值；溫度對(duì)硝酸改性XMG和硫酸改性XMG的影響不大，故采用硫酸和硝酸改性XMG時(shí)可在室溫15℃下進(jìn)行。酸改性秸稈材料實(shí)質(zhì)上是秸稈材料水解的過程，水解過程有利于引進(jìn)新的功能基團(tuán)［17］，故溫度越高，越有利于增加秸稈表面活性基團(tuán)的數(shù)量，與蘭培等［18］關(guān)于高溫有利于增加表面酸性官能團(tuán)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨著溫度的繼續(xù)升高，改性XMG吸菌量有下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)閄MG中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的水解溫度不同，若超過纖維素的水解溫度［19］，纖維素發(fā)生水解，則會(huì)損失吸附菌的活性基團(tuán)，導(dǎo)致吸菌量的下降。

由上述結(jié)果可以得到秸稈XMG的最佳改性條件，分別為5mol/L的硝酸在室溫15℃下改性60min、5mol/L的硫酸在室溫15℃下改性60min、10mol/L的乙酸在70℃下改性30min和5mol/L的硼酸在30℃下改性30min。

2.2 最佳改性條件下改性后XMG的吸菌性能和表面性質(zhì)

2.2.1 表面化學(xué)組成和吸菌性能

最佳改性條件下得到的4種改性XMG的表面官能團(tuán)含量和吸菌量列于表1。

表1 最佳改性條件下得到的4種改性XMG的表面官能團(tuán)含量和吸菌量Table 1 The content of surface functional groups and bacteria uptake of modified XMG obtained under optimal modification conditions

由表1可知，在最優(yōu)改性條件下得到的4種改性XMG的酸性官能團(tuán)含量整體上高于未改性XMG，堿性官能團(tuán)含量低于未改性XMG；其中，乙酸改性XMG的酸性官能團(tuán)含量（如羧基、羥基和內(nèi)酯基）相對(duì)較高、堿性官能團(tuán)含量相對(duì)較少。改性XMG吸菌量整體上高于未改性XMG，且乙酸改性XMG吸菌量明顯高于其他改性方法得到的XMG吸菌量。綜合表面官能團(tuán)和吸菌量的變化，以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的改性XMG為最佳的改性XMG載體。

由表1還可以看出，改性XMG的羧基、羥基和內(nèi)酯基的含量增多。Yang等［20］的實(shí)驗(yàn)表明，羧基和羥基含量的增加在一定程度上提高了秸稈的極性，從而更有利于微生物的固定化，與周林成等［14］關(guān)于微生物固定化的影響因素研究具有一致性。同時(shí)，酸改性減少了XMG表面灰分含量、中和了表面部分堿性官能團(tuán)，且改性時(shí)間越長(zhǎng)，其表面堿性官能團(tuán)含量越少，而堿性官能團(tuán)不利于吸附固定化微生物［10］，因此酸改性可以增強(qiáng)XMG的吸菌性能；乙酸改性XMG吸菌量最大，這與乙酸改性XMG的官能團(tuán)含量變化具有一致性，是由于XMG在吸附微生物時(shí)通過物理吸附極容易達(dá)到吸附飽和，而通過酸性官能團(tuán)固定微生物占主要部分，對(duì)吸附微生物起著重要的作用。

2.2.2 表面物理結(jié)構(gòu)

對(duì)以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的最佳改性XMG進(jìn)行SEM分析，探究XMG的吸菌性能和其物理結(jié)構(gòu)的關(guān)系，并與未改性秸稈XMG對(duì)照，結(jié)果示于圖4。

圖4 最佳改性XMG樣品和未改性XMG的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM images of XMG and optimal modified XMG sample（a）Modified XMG；（b）XMG

由圖4可知，改性前XMG表面比較規(guī)則、平整且致密，改性后XMG的表面粗糙，結(jié)構(gòu)較為疏松，出現(xiàn)了發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)為微生物的固著提供了有力的條件，同時(shí)易于吸附微生物分泌的酶、輔酶或石油烴污染物，從結(jié)構(gòu)上表明改性XMG比未改性XMG能夠吸附更多的微生物，與表1的結(jié)果具有一致性。

2.3 改性秸稈XMG固定化微生物修復(fù)石油污染土壤

以10mol/L的乙酸在70℃下改性30min得到的改性XMG作為載體材料，采用吸附法制備固定化微生物用于修復(fù)石油污染土壤，調(diào)整石油污染土壤的C、N、P質(zhì)量比為100∶10∶1、含水率為20%、翻耕頻率為1次/d，并以未改性XMG固定化微生物、游離微生物和土著微生物修復(fù)相同土壤為對(duì)照，結(jié)果示于圖5。

圖5 采用各種微生物修復(fù)石油污染土壤的石油降解率隨時(shí)間的變化Fig.5 The oil degradation rate of petroleum contaminated soil by different microbials vs time

由圖5可以看出，石油降解菌的投加明顯提高了石油降解的速率。降解35d，加入高效石油降解菌的土樣，石油降解率從18.2%升至30.3%，固定化微生物的石油降解率比游離微生物的高，達(dá)40.6%，改性XMG固定化微生物修復(fù)效果稍高于未改性XMG固定化微生物，石油降解率提高到42.9%。改性XMG固定化微生物和未改性XMG固定化微生物其修復(fù)效果在修復(fù)初始階段效果相差不大，這是因?yàn)樵诔跏茧A段主要進(jìn)行微生物的增殖，二者在本質(zhì)上沒有太大的區(qū)別，都是多孔的有機(jī)載體材料，為微生物提供一個(gè)良好的附著體和微環(huán)境的緩沖體系［21］。乙酸改性XMG吸菌量比未改性XMG有明顯的增多（見表1），但二者的石油降解率相差不多。這可能是因?yàn)椋环矫嫠岬奶幚碓黾恿薠MG表面官能團(tuán)的數(shù)量使其更有利于吸附微生物，但不利于吸附疏水性的石油烴類物質(zhì)；另一方面酸的處理可能破壞了XMG本身的多孔結(jié)構(gòu)，使得XMG吸附和微生物降解的協(xié)同作用［22］出現(xiàn)了阻力，結(jié)果使二者的石油降解率相近。

3 結(jié) 論

（1）秸稈XMG最佳改性條件為10mol/L的乙酸在70℃下改性30min。在該條件獲得的改性XMG，其酸性官能團(tuán)中羥基摩爾濃度從改性前的0.08mmol/L增至0.19mmol/L、內(nèi)酯基摩爾濃度從0.34mmol/L增至1.28mmol/L、羥基摩爾濃度從0.12mmol/L增至1.07mmol/L，吸菌量從0.209增至0.297，表明改性XMG有利于吸附微生物。

（2）對(duì)石油污染土壤進(jìn)行35d修復(fù)，固定化微生物的修復(fù)效果明顯強(qiáng)于游離微生物和土著微生物，而改性XMG固定化微生物的修復(fù)效果比未改性XMG固定化微生物修復(fù)效果略有提高，石油降解率從40.6%提高到42.9%。

［1］秦統(tǒng)福，沈本賢，周啟欣，等.包埋法固定UBD菌處理煉油污水工藝研究［J］.石油煉制與化工，2010，41（4）：68-70.（QIN Tongfu，SHEN Benxian，ZHOU Qixin，et al.Study on the biodegradation of refining wastewater by microbial immobilized UBD cells［J］.Petroleum Processing and Petrochemicals，2010，41（4）：68-70.）

［2］山丹，馬放，張思，等.同時(shí)培養(yǎng)法與吸附法微生物固定化對(duì)比［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，44（4）：53-57.（SHAN Dan，MA Fang，ZHANG Si，et al.Comparative study of two immobilization technologysimultaneity culture and adsorption［J］.Journal of Harbin Institute of Technology，2012，44（4）：53-57.）

［3］SHUCHI V，RENU B， VIKAS P. Oily sludge degradation by bacteria from Ankleshwar，India［J］.International Biodeterioration ＆ Biodegradation，2006，57（4）：207-213.

［4］王建龍.生物固定化技術(shù)與水污染控制［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：3-5.

［5］BYUNG J K，SOO J P.Influence of surface treatments on micropore structure and hydrogen adsorption behavior of nanoporous carbons［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2007，311（2）：619-621.

［6］ALBERTO C M，F(xiàn)ABIAN S G，AMELIA M A，et al.Activated carbon fibers with a high content of surface functional groups by phosphoric acid activation of PPTA［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2011，361（1）：307-315.

［7］DAE J K，HYUNG I L，JAE E Y，et al.Ordered mesoporous carbons：Implication of surface chemistry，pore structure and adsorption of methyl mercaptan［J］.Carbon，2005，43（9）：1868-1873.

［8］李亞婧，孫曉鋒，王廣征，等.秸稈的改性及吸油能力［J］. 化 工 進(jìn) 展，2012，31（8）：1847-1851. （LI Yajing，SUN Xiaofeng，WANG Guangzheng，et al.Modification of straw and its oil absorbency［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2012，31（8）：1847-1851.）

［9］RIVERA U J，SANCHEZ P M，GOMEZ S V，et al.Activated carbon modifications to enhance its water treatment applications ［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，187（1-3）：1-23.

［10］魏云霞，李斌，李彥峰，等.PVA大孔載體固定化微生物SBBR脫氮［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34（6）：43-47.（WEI Yunxia，LI Bin，LI Yanfeng，et al.Removing ammonia nitrogen by immobilized microorganism in SBR［J］.Environmental Science ＆Technology，2011，34（6）：43-47.）

［11］武金裝，劉紅玉，曾光明，等.柴油降解菌的篩選及其降解特性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（5）：1742-1746.（WU Jinzhuang，LIU Hongyu，ZENG Guangming，et al.Isolation of oil degradation bacteria and its characteristics in bio-degradation to diesel oil［J］.Journal of Agro-Environment Science，2008，27（5）：1742-1746.）

［12］SOO J P，SUNG Y J.Effect of ozone treatment on ammonia removal of activated carbons［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2005，286（1）：417-419.

［13］汪昆平，徐乾前.幾種不同處理方法對(duì)活性炭表面化學(xué)性質(zhì)的影響［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2012，6（2）：373-380.（WANG Kunping，XU Qianqian.Effect of several different treatment methods on surface-chemical properties of actived carbon［J］.Chinese Journal of Environmental Engineering，2012，6（2）：373-380.）

［14］周林成，李彥峰，候英鳳，等.大孔載體固定化微生物處理污水研究［J］.離子交換與吸附，2007，23（6）：531-539. （ZHOU Lincheng， LI Yanfeng， HOU Yingfeng，et al.Study on immobilized microorganism based on macroporous carrier and application for wastewater treatment ［J］.Ion Exchange and Adsorption，2007，23（6）：531-539.）

［15］邵娟，尹華，彭輝，等.秸稈固定化石油降解菌降解原油的初步研究［J］.環(huán)境污染與防治，2006，28（8）：565-567.（SHAO Juan，YIN Hua，PENG Hui，et al.Primary study on degradation of crude oil using an oil degrading bacteria immobilized by stalk ［J］.Environmental Pollution ＆ Control，2006，28（8）：565-567.）

［16］李海江，闞曉偉，姜子聞，等.秸稈材料的改性及其在水處理中的應(yīng)用研究［J］.高分子通報(bào)，2011，2：21-28.（LI Haijiang，KAN Xiaowei，JIANG Ziwen，et al.Modified straw materials and their applications in wastewater treatment［J］.Polymer Bulletin，2011，2：21-28.）

［17］SILVERSTEIN RA，CHEN Y，SHARMA S R，et al.A comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks［J］.Bioresource Technology，2007，98（16）：3000-3011.

［18］蘭培，張淑娟，潘丙才，等.氧化改性對(duì)活性炭吸附二苯并噻吩的影響［J］.化工環(huán)保，2012，32（5）：471-474.（LAN Pei，ZHANG Shujuan，PAN Bingcai，et al.Effect of oxidation modification on activated carbon adsorption activity to dibenzothiophene ［J］.Environmental Protection of Chemical Industry，2012，32（5）：471-474.）

［19］陳尚钘，勇強(qiáng)，徐勇，等.酸預(yù)處理對(duì)玉米秸稈纖維組分及結(jié)構(gòu)的影響［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（6）：13-19.（CHEN Shangyan，YONG Qiang，XU Yong，et al.Effects of dilute acid pretreatment on fiber components and structure of corn stover［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2011，26（6）：13-19.）

［20］YANG Y X，LU H Y，YING P L，et al.Selective dibenzothiophene adsorption on modified activated carbons［J］.Carbon，2007，45（15）：3042-3044.

［21］席本強(qiáng).多孔材料的特性分析［J］.科技信息，2007，23：316.（XI Benqiang.Analysis of the feature of porous material ［J］.Science ＆ Technology Information，2007，23：316.）

［22］張秀霞，秦麗姣，黃聰聰，等.微生物固定化載體的選擇及 其性能 ［J］.化 工進(jìn)展，2010，30（12）：2781-2786. （ZHANG Xiuxia， QIN Lijiao， HUANG Congcong，et al.Study on the selection of immobilized carrier and its performance［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2010，30（12）：2781-2786.）