宮頸癌中CyclinD1\\Ki-67\\P53的表達及與HPV16/18DNA感染的相關性研究

摘要：目的探討細胞周期因子CyclinD1、Ki-67、P53和HPV16/18在宮頸液基細胞上皮內病變（CIN）及宮頸癌組織中的表達及其臨床意義，研究HPV16/18感染與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達的關系。方法采用免疫組化（S-P）方法和原位雜交技術檢測50例宮頸癌組織、22例宮頸CIN以及20例正常宮頸組織中的CyclinD1、Ki-67、P53蛋白和HPV16/18DNA的表達情況。結果CyclinD1、Ki-67、P53蛋白和HPV16/18DNA在宮頸癌及CIN組中的陽性率分別為68.0%、84.0%、60.0%、80%；63.6%、68.2%、54.5%、72.7%均顯著高于正常宮頸組織10.0%、15.0%、0.0%、10.0%。且四者在宮頸癌中的陽性表達率與臨床分期、病理分級有關且呈遞增趨勢（P<0.05），與淋巴結轉移明顯相關（P<0.05），與年齡因素無關（P>0.05），另外HPV16/18DNA表達與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達之間呈正相關（P<0.01）。結論CyclinD1、Ki-67和P53在CIN及宮頸癌組織中高表達，HPV16/18病毒感染與宮頸癌發生發展密切相關，并與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達呈正相關，四者均可作為臨床宮頸癌篩查指標。

關鍵詞：宮頸癌；HPV16/18DNA

宮頸癌是女性生殖系統發病率處于第一位的惡性腫瘤，且近年來呈年輕化趨勢。人乳頭瘤病毒16，18（HPV16/18）感染與宮頸癌的發病密切相關。其與細胞增殖密切相關，可通過與細胞周期調控蛋白相互作用，促進細胞無限制增長而致癌[1]。原癌基因細胞周期素D1（CyclinD1）及細胞增殖抗原Ki-67都有促進細胞增殖作用，其在人類多種細胞系及腫瘤細胞中存在表達異常，引起蛋白的異常表達，促使腫瘤的異常發生。P53基因則是重要的抑癌基因，其突變或失活可促使多種腫瘤的發生[2]。本文采用免疫組化（S-P）方法和原位雜交技術檢測宮頸癌組織、宮頸CIN以及正常宮頸組織中的CyclinD1、Ki-67、P53蛋白和HPV16/18DNA的表達情況。結合臨床資料探究HPV16/18感染與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達的關系。

1資料與方法

1.1一般資料收集合肥市第一人民醫院病理科2010年4月~2013年12月的行宮頸活檢或手術切除且經病理確診的宮頸癌50例，術前均未行放療、化療或激素治療。年齡29~74歲，平均年齡46.7歲。按FIGO分期標準，Ia期10例、Ib期16例、IIa期24例。病理分級中，I級10例、II級23例、III級17例。宮頸CIN組織22例。正常宮頸組織20例。全部標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，厚度3~4um。正常宮頸組織的平均年齡43.4歲。

1.2免疫組化標記方法濃縮型兔抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人P53單克隆抗體，均購于福州邁新生物技術開發有限公司。具體染色步驟包括：脫蠟和水化，高壓加熱檸檬酸型組織抗原修復液，阻斷內源性過氧化物酶，分別加此三者抗體中的一種或空白對照試劑，加酶標聚合物，顯色，復染，脫水、透明、封片。

1.3原位雜交HPV16/18原位雜交檢測試劑盒購于中山大學達安基因股份有限公司。雜交檢測具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.4結果判斷CyclinD1、Ki-67及P53陽性染色主要定位于細胞核，均以出現棕黃色顆粒為標志。陽性標記細胞的平均百分率>5為陽性。HPV16/18原位雜交以細胞核內出現紫蘭色顆粒為陽性標志。

1.5統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行χ2檢驗和Fishers確切概率法分析，相關性分析采用非參數Spearman等級相關分析。

2結果

2.1 CyclinD1、Ki-67、P53和HPV16/18在不同宮頸上皮組織中的表達CyclinD1、Ki-67、P53的陽性表達均位于細胞核內，見圖1~6，50例宮頸癌中CyclinD1陽性表達34例，陽性表達率為68%，Ki-67陽性表達42例，陽性表達率為84%，P53陽性表達30例，陽性表達率為60%，見表1。

2.2 CyclinD1、Ki-67、P53及HPV16/18的表達與宮頸癌臨床病例因素間關系，見表2。

2.3 宮頸癌中HPV16/18感染與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達關系，見表3。

3討論

3.1 CyclinD1在宮頸病變中的表達情況CyclinD1在細胞周期中起正調節作用，其主要功能是與細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4/6結合，促進DNA轉錄，使細胞順利從G1期跨至S期，使得細胞發生分裂與增值，當CyclinD1表達異常，其使得細胞發生分裂增值紊亂，導致腫瘤的發生。

3.2 Ki-67在宮頸病變中的表達情況Ki-67抗原始出現于細胞有絲分裂G1期，S期及G2期表達量增加，M期表達量至高峰，消失于分裂晚期，但G0期無表達，因半衰期短，可以準確反映細胞的增值活性。同時與腫瘤的增值、浸潤、轉移以及預后均有密切聯系，是一個很可靠的腫瘤細胞增殖活性指標。本研究結果顯示；Ki-67在正常宮頸組織中低表達，但在CIN及宮頸癌中表達量顯著升高，分別為15.0%，68.4%，84.0%，宮頸癌與正常宮頸組織之間以及CIN與正常宮頸組織之間差異具有顯著性（P<0.05），宮頸癌與CIN之間需要進一步擴大樣本量來明確具體統計學差異。但實驗結果均提示Ki-67表達量的異常可能在正常宮頸組織發展至CIN及宮頸癌過程中起到一定的促進作用。

3.3 P53在宮頸病變中的表達情況P53是目前最常見的腫瘤相關抑癌基因，其抑制腫瘤細胞增殖及促其凋亡作用是通過多種信號通路實現，半衰期短，難以檢測，但突變后的P53基因半衰期較長，參與致癌作用。郭昕[3]報道發現P53蛋白表達量在正常宮頸組織、CIN以及宮頸癌中呈遞增趨勢，這與本研究結果基本符合，本實驗結果顯示：P53在正常宮頸組織中無表達，但在CIN及宮頸癌中表達量顯著升高，分別為0.0%，68.4%，60.0%；且P53對宮頸癌中的淋巴轉移密切相關。均提示P53參與宮頸癌的發生發展，是判斷宮頸癌發生發展預后的一項重要指標。

3.4 HPV16/18感染與宮頸病變的關系HPV是一種具有專屬在上皮和黏膜表面表達的特異性DNA病毒，人類女性宮頸鱗狀上皮及柱狀上皮交界處是HPV病毒的易感部位。本實驗對高危型HPV16/18展開研究，結果發現其在正常宮頸組織中無表達，但在CIN及宮頸癌中表達量顯著升高，前者分別與后兩者相比差異具有顯著性（P<0.05）。本實驗進一步運用相關分析，研究發現HPV16/18DNA表達與CyclinD1、Ki-67和P53蛋白表達之間呈正相關（P<0.01）。提示在HPV16/18DNA高表達的宮頸癌中，此三者標記物表達量明顯增加，其可能在宮頸癌的發生發展中起著共同促進作用，具體信號通路有待于后續進一步研究。

參考文獻:

[1]張洪文，宋麗君.HPV對細胞周期調控影響的研究進展[J].國外醫學生理、病理科學與臨床分冊，2004，24(4):325-327.

[2]孫軍，夏和順，陳生路，等.BCL-2、P53在宮頸鱗狀上皮不典型增生.鱗狀上皮癌中表達及意義[J].中國腫瘤臨床與康復，2001，8(1):13-16.

[3]郭昕.C-MYC 和P53 在宮頸癌組織中表達及臨床意義[J].局解手術學雜志，2005，14(3):147-148.編輯/申磊