新生大鼠皮層神經元原代培養及糖-氧剝奪損傷模型的建立

摘要：目的建立較為簡便的新生大鼠皮層神經元細胞原代培養方法并建立糖-氧剝奪細胞損傷模型。方法取新生的大鼠（24 h）大腦皮層組織，消化后種植在多聚-L-賴氨酸包被的六孔培養皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液種植，4~8 h后換再用含有B27的Neurobasal培養基維持飼養。于不同時間點在倒置相差顯微鏡下觀察形態變化，用免疫組化方法對神經元特異性標記物NSE染色鑒定。選取培養第7 d的神經元隨機分為不作處理的對照組和過糖-氧剝奪建立細胞損傷模型組，Western blotting檢測NSE蛋白表達。結果2~8 h神經元細胞貼壁，隨著時間的延長，形態呈多變，突起逐漸增多，神經元突起間相互接觸形成網絡，培養7~10 d時神經元胞體最為豐滿，通過免疫組化驗證證明所分離培養的是神經元細胞。糖-氧剝奪細胞損傷模型組NSE蛋白表達量較對照組NSE蛋白表達量明顯降低。結論該神經元方法簡單易行，神經元純度較高，并成功的建立糖-氧剝奪神經元損傷模型。

關鍵詞：神經元；原代培養；neurobasal培養基；B27；糖-氧剝奪；細胞模型

神經元細胞培養技術是一種常用的技術，廣泛用于神經系統疾病的細胞模型[1]，可為神經系統的發病機制和神經保護性藥物的篩選提供良好的平臺。在以往關于缺血/缺氧腦損傷的研究中，主要集中在動物體內研究，雖然在體試驗更接近動物的實際狀態，但易受到其他因素影響。體外原代培養神經元細胞，可以得到比較均一的細胞，可根據實驗要求控制神經元細胞的生成，有利于動態觀察神經元細胞的形態學變化，從而避免了體內研究的許多復雜因素的影響[2]。

1資料與方法

1.1一般資料 出生后新24 h內的SD大鼠，購于新疆醫科大學實驗動物中心； Neurobasal培養液、B27培養基添加劑、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培養基（Hyclone）；神經元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（abcam公司）；多聚-L-賴氨酸、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉生物技術有限公司）。無血清培養基： Neurobasal培養基+2%B27培養基添加劑(50x)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+ 雙抗(100U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，于冰箱4℃保存備用；多聚-L-氨酸包被液：用PBS液配制0.1 mg/mL多聚-L-氨酸溶液，0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存備用。

1.2方法

1.2.1大鼠皮層神經元的分離和培養 取24 h內新生的SD大鼠，采用頸椎脫臼處死小鼠后，放入盛有75%酒精的燒杯中消毒1～2 min。在無菌的環境下用剪刀迅速斷頭，用預冷的PBS液中漂洗干凈移入另一個裝有預冷H-DEME的容器內，充分暴露大腦皮層，在顯微鏡下剝盡皮層的腦膜及血管，將皮層組織剪成碎組織塊，向剪碎的組織中加入濃度為0.05%的胰酶在37°C下進行消化，15 min后 終止消化作用。使用1 mL進口槍頭對組織進行反復吹打（10次），注意動作要輕柔，且不可產生氣泡。 將吹打后的細胞懸液轉移入15ml的離心管中于4°C離心 1000 rpm，5 min，使用配制好的培養液對細胞進行重懸。200目篩網過濾，以1×106個細胞/mL，接種于經多聚賴氨酸包被的6孔培養板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM-HG培養液2 mL，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養，4~8 h后用neurbasal+B27培養液換全液1次，以后每隔3 d半量換液1次。培養，4~8 h后用neurbasal+B27培養液換全液1次，以后每隔3 d半量換液1次。

1.2.2大鼠皮層神經元鑒定 免疫細胞化學方法驗證神經元細胞的特異性和純度皮層神經元培養到第7 d時，胞體發育飽滿，取出爬片，選擇NSE作為皮層神經元特異性標志物，按標準的免疫細胞化學染色法進行鑒定，按說明書步驟進行，以PBS緩沖液代替I抗作陰性對照。隨機去3個視野計數陽性細胞百分數并照片。

1.2.3糖-氧剝奪損傷模型的建立 選取培養7 d的神經細胞，吸去培養基并用PBS液輕輕沖洗2遍，用95%氮氣和5%二氧化碳氣體飽和10 min后的無糖培養基造成缺糖環境，在充滿氮氣的37℃的細胞培養箱孵育45 min，然后換回原培養液，在37℃ 5%CO2細胞培養箱中孵育6 h。

1.2.4 Western blotting檢測神經元細胞的NSE蛋白表達水平 分別提取對照組和糖-氧剝奪組神經元蛋白提取，煮沸變性，電泳2 h，封-閉1~2 h，加一抗NSE (1∶500)、4℃過夜，加HRP標記抗兔二抗孵育1~2 h（1∶30000），曝光rad凝膠成像系統分析結果。

1.2.5統計學方法 運用SigmaStat 3.5統計軟件，進行單因素方差分析，實驗數據用表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 SD大鼠原代培養皮層神經元的形態學觀察在倒置顯微鏡下觀察，剛種植的皮層神經元呈圓形、體積小、透亮、單個散在分布，見表1。2 h后開始有貼壁，8 h后大部分已貼壁。3~4 d細胞已有明顯的增長的突起，以多級神經元為主，胞體為三角形、梭形、橢圓形、椎體形幾不規則形。5~6 d后神經元細胞體進一步變大，突起增粗，連接形成網絡。7~8 d時，細胞體積繼續增大，胞體飽滿，突起分支增大，形成致密網絡。14 d細胞數量開始減少。經過氧-糖剝奪后的細胞從形態學觀察貼壁能力下降，細胞間隙增大，遮光性降低，少數細胞壞死。

圖1 體外培養不同時間大鼠皮層神經元形態觀察

2.2免疫組化染色的觀察結果，見圖2 取第7 d的神經元細胞，NSE免疫組化染色（DBA顯色），胞漿和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的為陽性細胞，整個細胞都不被染色為陰性細胞，見圖3C。在顯微鏡下進行觀察，以3個視野中陽性神經元的數目占總細胞的比例為神經元純度，經鑒定神經元純度為90%左右。

2.3 Western blotting測定對照組和糖氧剝奪損傷組中細胞NSE和β-actin表達（圖3）糖-氧剝奪細胞損傷模型組NSE蛋白表達量較對照組NSE蛋白表達量明顯降低，差異無統計學意義（P<0.05）。

圖2 皮層神經元特異性烯醇化酶免疫組化染色（×400）

圖3 各組中NSE蛋白的表達（*與對照組比較P<0.05）

3討論

體外培養神經元是較困難的原代培養技術，為成功培養出神經元，首先應選用新生（24 h內）大鼠，因為剛剛出生的大鼠的神經元和神經膠質細胞均為分化成熟，可較容易養活。其次是組織塊的消化、分離和接種的過程。必須嚴格控制胰酶的濃度和消化時間，可采用胰酶低濃度，延長消化時間來達到消化均一的效果，盡可能的減少機械損傷。再次是培養基的選擇。血清培養的細胞狀態很不均一，從正常到凋亡都有，嚴重影響試驗準確，而無血清專用培養基所有的正常細胞都處于一樣的狀態，要么都好，要么都差，高度一致。無血清培養基neurobasal是較好的培養基。需要的添加劑為 B27，培養出的細胞狀態均一，膠質細胞幾乎不分裂。

在體外培養神經元基礎上氧-糖剝奪模型是模擬在體缺血模型，又稱\"離體缺血模型，大致可分為：化學缺血模型和氧-糖剝奪模型。化學模型如氰化物可抑制養花磷酸化，從而阻斷了ATP的產生。氧-糖剝奪模型采用去氧處理過的無糖培養基孵育細胞，再放入缺氧箱，使細胞處于缺氧、缺糖狀態。細胞缺氧比較均一。離體細胞模型的實驗條件容易控制、恒定，卻可以在損傷過程中評價細胞功能，離體藥物評價和篩選可直接作用細胞。本課題組采用用95%氮氣和5%二氧化碳氣體飽和10 min后的無糖培養基造成缺糖環境，在充滿氮氣的37℃的細胞培養箱孵育45 min，然后換回原培養液，在37℃ 5%CO2細胞培養箱中孵育6 h，造成一根缺血再灌注損傷模型。經過氧-糖剝奪后的細胞從形態學觀察貼壁能力下降，細胞間隙增大，遮光性降低，少數細胞壞死，并通過Western blotting檢測NSE蛋白表達。NSE主要存在中樞神經系統和神經分泌細胞中。在缺血/缺氧致神經元細胞損傷中，干擾了神經元的代謝變化，神經元細胞膜的功能和結構受損，NSE從胞漿中釋放至細胞外，則細胞中NSE含量下降，NSE的含量可敏感的反應神經元損傷程度。在對照組和模型組中NSE蛋白表達的差異比較，氧-糖剝奪模型組NSE蛋白明顯降低，差異有統計學意義。表示達到了缺血缺氧目標，較好的模擬了急性缺血對細胞的損傷模型。

參考文獻：

[1]喬治·阿德爾曼．神經科學百科全書 [M]．神經科學百科全書翻譯編輯委員譯[M]．上海:伊克豪伊薩爾出版社，上?？茖W技術出版杜，1992:1043-1050．

[2]Mitchell P J， Hanson J C， Quets-Nguyen A T， et al. A quantitative method for analysis of< i> in vitro neurite outgrowth[J]. Journal of neuroscience methods， 2007， 164(2): 350-362.

編輯/張燕