CLSI方案評價亞硝酸鈉氧化法和釩酸鹽氧化法檢測血清總膽紅素

戴 波 楊小彤 韋忠毅

（1.湖南食品藥品職業學院，湖南 長沙410208；2.湖南圣湘生物科技有限公司，湖南 長沙410013）

膽紅素的測定，傳統使用重氮試劑法，該法使用時間較早，測值準確，但其試劑穩定性差、副反應明顯。經過多次改良仍然不能消除其比較明顯的缺點。化學氧化法包括釩酸鹽氧化法、亞硝酸鹽氧化法、過硫酸鹽氧化法及綜合氧化法等，化學氧化法因其具有抗干擾能力強、線性范圍寬、重復性好及準確度高[1]等優點現在是最流行的測定血清膽紅素的方法。目前市場主要使用釩酸鹽氧化法和亞硝酸鹽氧化法，且兩方法使用的原料差別不大，試劑性能也相近，本實驗參考CLSI的部分評價方法，主要通過精密度，線性范圍，抗干擾性能三方面比較兩試劑的區別，方便實驗室或醫院根據不同的需要選擇。

1 材料

1.1 試劑和儀器

儀器使用日立7080全自動生化儀，試劑使用北京利德曼生化股份有限公司生產的總膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽法）以及上海榮盛生物藥業有限公司生產的總膽紅素測定試劑盒（亞硝酸鹽法）。

1.2 標準液與質控液

標液使用朗道定標血清2350-794，質控液使用朗道質控血清1530-791，1532-616。

1.3 樣本

選用當天新鮮血清，無溶血，脂血（黃疸樣本可作為高值樣本）。

1.4 干擾物

抗壞血酸干擾物：100g/L的抗壞血酸注射液用生理鹽水稀釋到10g/L。肝素干擾物：使用12500U/支的肝素抗凝劑。枸櫞酸鈉干擾物：使用3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑。血紅蛋白干擾物：為外購干擾試劑。

1.5 數據分析

使用IBM SPSSStatistics 19數據分析軟件進行統計分析。

2 實驗方法

2.1 精密度測試

參考CLSI EP5[2]文件要求：取高值和低值的血清樣本各一份，用兩總膽紅素試劑測試高低值樣本各20次，計算批內精密度。取高值和低值血清各一份，分裝為20份于-20℃左右避光保存。每天取高低值各一份用兩試劑各進行一次測試，連續測試20天，測定批間精密度。

2.2 線性評價

參考CLSI EP6[3]文件要求：根據兩試劑的線性范圍，釩酸鹽氧化法（0-684μmol/L），亞硝酸鹽氧化法（0-427μmol/L），取能覆蓋其線性范圍的高值樣本（H）與生理鹽水為低值樣本（L），按H：L為1：19,1：9,1：4，2：3,4：1，的比例配制5個濃度的樣本，與H一起組成6個濃度不等間距排列的樣本。每個濃度水平進行兩次重復測試。對結果進行線性分析。

2.3 抗干擾評價

參考CLSI EP7[4]文件要求：先進行干擾篩選，計算出兩試劑對個干擾物的點估計值（dobs）和臨界值（dc），進行比較選出有干擾效應的干擾物。后進行測試劑量效應，精確干擾物濃度的影響。

3 實驗結果

3.1 精密度

精密度CV值結果詳情見表1：高值（192.5μmol/L）,低值（23.4μmol/L），兩試劑測試精密度結果良好，亞硝酸鹽氧化法試劑在低值測試上稍優于釩酸鹽氧化法試劑。

表1 高低值精密度測試結果

3.2 線性范圍

釩酸鹽氧化法在（0-700μmol/L）范圍時，線性良好，Y=0.979X-6.001，r=0.99995。亞硝酸鹽氧化法在（0-500μmol/L）范圍時，線性較好，Y=0.943X-1.024，r=0.99927，但對接近500的值測試結果已經不太理想。

圖1 釩酸鹽氧化法線性關系

圖2 亞硝酸鹽氧化法線性關系

3.3 抗干擾

對肝素，抗壞血酸，枸櫞酸鈉，血紅蛋白等干擾物進行篩選，比較結果后得枸櫞酸鈉對兩膽紅素試劑無干擾效應。肝素對兩試劑呈現為正干擾。抗壞血酸，及血紅蛋白對試劑均有不同程度的負干擾。再使用肝素、抗壞血酸、血紅蛋白等煩擾無進行劑量實驗，得出結果如表2，表2表明了這三種干擾物對兩種膽紅素試劑測定結果的影響。

表2 干擾實驗結果

4 結論

膽紅素氧化法的原理是在pH=3的條件下，血清膽紅素可以經釩酸鹽氧化成膽綠素。從而使膽紅素特有的黃色減少，可根據其吸光度下降的差值來計算出膽紅素濃度。亞硝酸鹽氧化法的原理是在適合的緩沖液中加入特定的加速劑，使血清膽紅素被反應介質中新生成的亞硝酸氧化成淡綠色化合物，引起膽紅素吸光度下降。精密度測試結果中，亞硝酸鹽氧化法對低值的測試比釩酸鹽氧化法較好，但在測試高值的時候就沒有這些差別了，可能是因為釩酸鹽自帶的淡黃色的照成試劑空白吸光度稍大于實際值。其影響在可接受范圍內，精密度CV值均在5%以內，準確度偏差也在范圍內。釩酸鹽氧化法試劑在（0-700μmol/L）范圍內結果良好。亞硝酸在（0-500μmol/L）范圍內結果也可接受，但對更高的值進行測試時已經偏差較大，不推薦使用。因此在測定范圍上，釩酸鹽氧化法試劑要明顯優于亞硝酸氧化法試劑。兩試劑的干擾篩選結果是一致的，肝素對兩試劑干擾效應也一致。但是抗壞血酸與血紅蛋白對亞硝酸鹽氧化法試劑的干擾效應要比對釩酸鹽氧化法試劑的強。由于條件限制，不能使用更多的干擾物進行實驗，但總體來說，釩酸鹽氧化法試劑的抗干擾能力要大于亞硝酸氧化法試劑。

［1］曾東良.釩酸鹽氧化法與干化學法測定總膽紅素的方法學比較[J].華夏醫學,2005,18(1)：33-35.

［2］Daniel W.T.,Anders K,John W.K.,et al..Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods[S].NCCLSDocument EP5-A2,2004,24(25)：8-14.

［3］Daniel W.T.,Martin K.,J.Rex A.,et al..Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods[S].NCCLSDocument EP6-A,2003,23(16)：10-16.

［4］Donald M.P.,James C.B.,Melvin R.G.,et al..Interference Testing in clinical Chemistry[S].NCCLSDocument EP7-A,2002,22(27)：25-30.