抗豬瘟病毒單鏈抗體基因的構建及其推導的蛋白質三級結構的分子模擬

劉金鳳， 吳健敏， 覃紹敏， 白安斌， 陳鳳蓮， 曹穎穎

(廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西 南寧 530001)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種以高熱、出血及高死亡率為特征的接觸性烈性傳染病，在世界范圍內廣泛流行，一旦暴發將會對當地養豬業造成毀滅性的打擊，已成為危害全球養豬生產的重要經濟性疫病之一［1-4］。在中國，雖然依靠兔化弱毒疫苗免疫，較好地控制了豬瘟的大規模流行，但零散發生仍然存在，并且發病特點發生了變化。為此，對豬瘟的防治依舊面臨著嚴峻的挑戰，而在豬瘟的綜合防治中，如何快速、準確診斷具有非常重要意義。

免疫學檢測是病原微生物診斷的主要手段，其關鍵技術在于獲得高效的可用于檢測的抗體。目前，以單鏈抗體為代表的基因重組抗體技術為抗體的制備提供了新途徑。單鏈抗體(ScFv)是由免疫球蛋白質的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)通過一段連接肽連接形成的單一肽鏈重組蛋白質，它具有完全抗原結合位點的最小抗體片段，分子量小、滲透性高，特異性強，而且抗體的親和力和特異性在制備過程中均能較為容易控制，因此在免疫學檢測與醫學診斷中具有重要的應用價值和廣泛的應用前景［5-7］。本研究在獲得分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株的基礎上，利用基因工程方法擴增了抗體可變區基因VH和VL，組裝成單鏈抗體基因(CSFV-ScFv)，并進行克隆和測序鑒定，同時利用計算機軟件對CSFV-ScFv基因及其所編碼蛋白質的性質進行詳盡分析，為進一步建立以單鏈抗體技術為支撐的CSFV病原快速檢測方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CSFV單克隆抗體雜交瘤細胞株anti-CSFV14［8］、大腸桿菌DH5α感受態細胞由廣西獸醫研究所診治中心實驗室制備與保存;pMD18-T載體、DNA marker、限制性內切酶、RevertAidM-MuLV Reverse Transcriptase、pfu 聚合酶、Ex Taq DNA Master Mix、RNase抑制劑購自 TaKaRa公司，質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自北京天根生物公司，TRIzol試劑購自Invitrogen公司，酵母抽提物及胰蛋白胨購自OXID公司，其他生化試劑均為國產分析純級產品。

1.2 引物及Linker設計

參照文獻［9］設計鼠源抗體重鏈及輕鏈可變區的擴增引物，連 接 肽Linker采用文獻［10］報道的較常用的(Gly4Ser)3形式;將Linker設計在VH基因的下游引物和VL基因的上游引物，并分別在兩端引入酶切位點BamH I和Not I，序列由北京博邁德基因有限公司合成，具體如表1。

表1 CSFV-ScFv基因引物序列Table 1 The primer sequences of CSFV-ScFv gene

1.3 雜交瘤細胞總RNA提取及cDNA合成

PRRSV雜交瘤細胞株anti-CSFV14復蘇培養，待細胞長至對數生長期，細胞計數約8×107時，1 200 r/min離心3～5 min收集細胞，在無RNA酶的條件下按 TRIzol試劑盒操作說明書提取細胞總RNA，并取少量總RNA用紫外分光光度儀進行純度和濃度鑒定。反轉錄過程按TaKaRa逆轉錄酶(MMuLV)產品說明書進行。

1.4 VH和VL基因的擴增

以合成cDNA第一鏈為模板，分別以VH基因上、下游引物(VH-B、VH-F)和VL基因上、下游引物(VL-B和VL-F)擴增VH基因和VL基因。PCR反應體系按常規比例配成50 μl(反應程序:95℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環;72℃ 10 min)。取5 μl PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收獲得VH和 VL基因，并直接進行DNA測序。

1.5 全長CSFV-ScFv基因的擴增

以上述的純化產物為模板，用引物VH-F1、VH-Linker-B和 Linker-VL-F、VL-B1分別進行 VHLinker和Linker-VL序列的擴增(反應體系和反應程序同方法1.4)，PCR產物經電泳鑒定后進行純化回收。取純化產物等摩爾混合，通過PCR反應完成VH-Linker-VL片段的預拼接(預拼接程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環;72℃ 10 min)，再以2 μl預拼接產物為模板，用VH-F1、VL-B1引物進行VH-Linker-VL全長基因的拼接，拼接程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環;72 ℃ 10 min。PCR產物經電泳鑒定后進行純化回收，獲得VHLinker-VL全長基因片段。

1.6 CSFV-ScFv基因的克隆與鑒定

將全長ScFv純化回收后與 pMD-18T載體連接，連接體系與程序參考載體說明書。將連接產物按常規方法轉化DH5a感受態細胞，挑取單菌落提取質粒，經過BamH I與Not I酶切鑒定正確的重組質粒pMD-CSFV-ScFv送至北京華大公司進行核酸序列測定分析。

1.7 CSFV-ScFv基因所編碼的蛋白質的結構預測

基于CSFV-ScFv基因的核苷酸序列，利用Edit-Seq推導其氨基酸序列，利用NCBI的blasp、Igblast進行氨基酸序列的同源性分析和IgG結構域分析，利用ExPASy服務器上的ProtParam軟件分析CSFVScFv分子理化性質，利用 NPSA在線服務器預測CSFV-ScFv二級結構，最后采用SWISS-Model在線服務器預測CSFV-ScFv三級結構，并進行同源建模。

2 結果

2.1 VH、VL基因片段的擴增

提取對數生長期的抗PRRSV單克隆抗體雜交瘤細胞anti-CSFV14的總RNA，測定其濃度為1 262 ng/μl。以此RNA為模板擴增VH和VL基因，擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果(圖1)顯示，獲得預期的約363 bp的VH基因和約324 bp的VL基因。

圖1 CSFV VH、VL基因擴增結果Fig.1 PCR amplified products of CSFV VH and VL genes

2.2 全長CSFV-ScFv基因的擴增拼接

以純化的VH與VL基因為模板分別擴增出長約410 bp的VH-Linker及長約369 bp的Linker-VL基因片段(圖2)，將 VH-Linker與 Linker-VL等量混合，在PCR反應中完成 VH-Linker-VL的預拼接，再以預拼接產物為模板進行VH-Linker-VL全基因的拼接擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得預期長約730 bp的目的基因(圖3)。

圖2 VH-Linker、Linker-VL基因擴增結果Fig.2 PCR amplified products of VH-Linker and Linker-VL genes

圖3 全長CSFV-ScFv基因擴增結果Fig.3 PCR amplified products of full-length CSFV-ScFv gene

2.3 CSFV-ScFv基因的克隆及酶切鑒定

將純化的CSFV-ScFv基因與pMD-18T載體進行連接，轉化感受態細胞，提取單菌落質粒，經BamH I和Not I雙酶切鑒定后，發現重組質粒pMDCSFV-ScFv可切出約730 bp的外源基因片段(圖4)。

圖4 pMD-CSFV-ScFv重組質粒的酶切鑒定結果Fig.4 Ⅰdentification of pMD-CSFV-ScFv recombinant plasimid

2.4 CSFV-ScFv重組質粒的測序及分析

將酶切鑒定正確的重組質粒進行序列測定，結果顯示所擴增的單鏈抗體基因全長732 bp，由預期的VH基因、VL基因和Linker組成，其中 VH基因位于Linker的上游，大小為363 bp，為一開放閱讀框，不含終止密碼子，可編碼121個氨基酸;序列中有明確的3個互補決定區(CDR)和4個框架區(FR)，第22、96位的氨基酸殘基為抗體可變區特征性的半胱氨酸殘基，核苷酸序列與鼠源的重鏈可變區框架相似率最高達90.28%，表明VH基因所編碼的氨基酸序列符合鼠抗體可變區基因特征。VL基因則位于Linker下游，長324 bp，基因內無終止密碼子，編碼108個氨基酸，序列中亦有明確的CDRs和FRs，抗體可變區特征性的半胱氨酸殘基位于第23、88位，核苷酸序列與鼠源的輕鏈可變區框架相似率最高達92.83%，表明VL基因所編碼的氨基酸序列符合鼠抗體可變區特征。Linker大小為45 bp，編碼15個氨基酸殘基。序列詳見圖5。

2.5 CSFV-ScFv蛋白質結構的分析預測

2.5.1 CSFV-ScFv氨基酸序列比對分析 將VH、VL及ScFv基因編碼的氨基酸序列經NCBIblastp檢索分析，發現了IgG典型的可變區結構域(IGV)，并與多種已登錄的鼠單鏈抗體同源性很高，與ScFv anti-White Spot Syndrome Virus(AAY88909.1)同源性最高達79%，具有鼠源單鏈抗體可變區的所有特征。

2.5.2 CSFV-ScFv蛋白質理化性質與二級結構預測分析 用蛋白質序列分析軟件分析蛋白質理化性質，并對其二級結構進行預測分析。CSFV-ScFv基因所編碼蛋白質分子式為C1164H1767N317O363S8，原子數3 619，理論相對分子質量為26 266.2，等電點為8.93，不穩定系數為35.05，為不穩定蛋白質，疏水氨基酸92個，占37.7%，親水性評估值為-0.425，為親水性蛋白質。二級結構預測結果顯示，該蛋白質主要由β-片層和無規則卷曲組成。其中，17個氨基酸殘基可形成α螺旋，占6.97%，92個氨基酸殘基形成自由伸展，占37.70%，135個氨基酸殘基可形成無規則卷曲，占55.33%，Linker呈無規則卷曲(圖6)。

2.5.3 CSFV-ScFv蛋白質三級結構分子建模 經序列比對發現2gki.1所編碼的氨基酸序列與目的基因CSFV-ScFv所編碼的氨基酸序列同源性可達到72.20%，根據同源建模的思路，運用SWISS-Model軟件進行同源建模，模擬CSFV-ScFv蛋白質三級結構，模擬結構可靠。結果顯示，重鏈可變區主要由10個β片層折疊形成，輕鏈可變區主要由11個β片層折疊形成。三級結構中連接肽無規則卷曲形成索狀結構，將VH和VL牽拉而相互靠近，形成一個口袋樣形狀的溝槽結構，以利于抗原結合(圖7)，理論上具有良好的抗原結合活性。

圖5 CSFV-ScFv基因及其所推導的氨基酸序列Fig.5 The CSFV-ScFv gene and its deduced amino acid sequence

圖6 CSFV-ScFv蛋白質二級結構預測Fig.6 The prediction of secondary structure of CSFV-ScFv protein

圖7 CSFV-ScFv蛋白質三級結構同源建模Fig.7 The 3D structure homology modeling of CSFV-ScFv protein

3 討論

抗體在免疫學檢測的應用由來已久，早在19世紀末，人們就能通過免疫動物獲得抗血清。1975年，Kohler等［11］建立的B淋巴雜交瘤細胞技術更是抗體生產的重大技術革命，不僅為醫學與生物學研究開創了新紀元，也為臨床疫病的診斷和治療提供了新的工具。然而由于單克隆抗體制備過程復雜，價格昂貴，很大程度上限制了它的臨床使用。隨著基因工程抗體技術的發展，單鏈抗體技術走進了人們的視野，單鏈抗體由于分子量小，穿透性強，免疫原性低，體內易于清除，利于進行基因工程操作，在疾病預防、診斷和治療中顯示了巨大的應用前景。以單鏈抗體替代傳統的IgG抗體為檢測元件應用于病原微生物的檢測具有明顯的優勢。與傳統單抗比，單鏈抗體制備簡單，成本低廉而又具有親代抗體的全部抗原結合位點，Nimmagadda等［12］以 HAVScFv基因為基礎建立的免疫捕獲ELISA檢測方法，與商業化單克隆抗體檢測試劑盒應用效果無明顯的差異，證實單鏈抗體具有親本抗體相同的免疫活性。此外，單鏈抗體基因工程操作更簡便，其N端或C端可與其他分子拼接構建雙功能分子，除替代傳統抗體用于建立ELISA等檢測方法外，還可應用于疫病的快速檢測領域，如覃紹敏等［13］以抗人紅細胞單鏈抗體與豬瘟E2基因融合蛋白質為基礎建立的紅細胞凝集試驗可快速、簡便、準確地進行豬瘟抗體的檢測。目前，國內外學者已經研制出多種單鏈抗體基因，并應用于臨床［14-15］。

本研究在前期的試驗中獲得1株高親和力的抗豬瘟E2蛋白質單克隆抗體雜交瘤細胞anti-CSFV14的基礎上，通過合成通用引物，分別進行單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因的擴增，并進行測序。測序結果用IMGT數據庫、NCBI數據庫平臺提供的在線分析工具進行驗證，通過分析，證實了基因序列的正確性，并根據分析的結果重新設計了后續的引物進行VH基因、VL基因的修正以及CSFV-ScFv基因全長的拼接克隆及結構預測分析。

單鏈抗體的表達量及其免疫活性和其構建方法密切相關，不同的連接順序會影響ScFv的二聚或多聚化的行為［16］，進而影響單鏈抗體表達產量及其三維空間構象的形成，最終影響單鏈抗體的生物活性。很多研究結果表明，VL-Linker-VH的連接方式可表現出更強的形成高分子聚合物的趨勢，在進行分泌表達時其表達量要高于VH-Linker-VL的10～20倍，但VH-Linker-VL基因表達的蛋白質要比VL-Linker-VH基因表達的蛋白質顯示出更大的結合活性［17-18］，因此，基于抗體活性效價考慮，我們選取了親和力較好的VH-Linker-VL連接方式構建CSFVScFv基因。Linker的設計對保持親本抗體的親和力有重要影響，它必須能使VH和VL易于自由折疊，使抗原結合位點處于適當的構型，并不引起其分子動力學改變，避免對抗原結合部位造成干擾。目前報道使用最多的Linker是Huston根據X線晶體衍射分析抗體可變區結構及計算機輔助分析結果設計的15肽序列(Gly4Ser)3，該序列已經有許多成功應用的報道，因此本研究中亦選用此序列。

蛋白質同源建模是基于查詢的蛋白質氨基酸序列與已知蛋白質氨基酸序列顯著的相似性來預測蛋白質三維結構的方法，是一種可靠的、廣泛接受的具有實用性的結構預測技術。通常蛋白質的氨基酸序列間相似度應高于30%，表示空間結構相似，低于30%時，序列比對時會搜索到大量的非相關蛋白質，難以用于同源建模［19］。我們對所得到的CSFV-ScFv基因進行同源建模分析時，搜索到的模型蛋白質與靶蛋白質的相似度為72.20%，所以對靶蛋白質的模擬結果可靠度高。從模擬結果可看出，CSFVScFv屬于 β-片層結構，其相鄰的兩條 β-鏈反向平行，形成由輕鏈連接的β-片層結構，兩個片層之間通過疏水作用和二硫鍵穩定。ScFv的理化性質分析可知，ScFv為不穩定蛋白質。此外，從蛋白質的三級結構還可看出，目的蛋白質的VH和VL結構域相互靠近，形成一個相對致密的分子，Linker則游離在外，使VH和VL形成一個口袋結構，這樣的結構可能有利于抗體識別和結合抗原。

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