紅景天提取物類脂質體的制備及表征

房辰晨，孫敬蒙，盧美彤，張煒煜

1. 長春中醫藥大學藥學院（長春 130117）；2. 吉林大學白求恩第一醫院藥學部（長春 130021）

紅景天（Rhodiola rosea）是景天科多年生草本植物，主要分布于吉林、西藏、新疆及云南西北部等地，由于其生長在高原環境，因此具有較強的生命力及獨特的藥用價值[1]，作為傳統藏藥，其應用廣泛且具有悠久的藥用歷史，常用于心血管疾病的治療。紅景天提取物的化學成分主要有紅景天苷、黃酮、多糖等，具有擴張血管、降血壓、降血脂、改善微循環、抗腫瘤等藥理作用。紅景天苷是紅景天藥材的主要活性成分，臨床上主要用于治療由心血瘀阻導致的冠心病和心絞痛等疾病[2-3]。但是，紅景天苷在吸收過程中由于受到主動外排機制的影響，生物利用度低[4]、半衰期短[5]。類脂質體是具有類似細胞膜結構的雙分子層囊泡，由膽固醇、非離子型表面活性劑通過化學結合形成的一種單層或多層的新型藥物載體。具有良好的細胞親和性、組織相容性及緩釋性等特點，且不易泄漏。其結構與脂質體類似，但與脂質體相比，因其不含磷脂，在制備過程中不容易受環境影響氧化或水解[6]，所以更加穩定。因此，將紅景天提取物制備成類脂質體，其膜材中的聚氧乙烯基在其表面形成了立體位阻屏障，使其不易被巨噬細胞所識別和攝取，延長紅景天的體內作用時間，提高療效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅景天，吉林省仙草醫藥藥材有限公司；紅景天提取物標準品，中國食品藥品檢定研究院；Span 80，湖南華日制藥有限公司；Span 40，上海山浦化工有限公司；膽固醇（分析純），天津天泰精細化學品有限公司；甘露醇，安徽山河藥用輔料股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

AR2140型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機，上海安亭科學儀器廠；Agilent 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SD-1000型噴霧干燥機，東京理化器械株式會社；NS1001L2K型高壓均質機，意大利Niro Soavi公司；KQ2200超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；JEOL透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；DSC3差示掃描量熱儀，梅特勒-托利多儀器有限公司；NICOMP 380/ZLS激光粒度儀，美國PSS粒度儀公司。

1.3 方法

1.3.1 紅景天提取物的制備

取適量紅景天藥材，加8倍量水，提取3次，每次1 h，合并濾液，加乙醇調節至醇體積分數70%，以10% NaOH溶液調節濾液pH 8，離心取上清液，濃縮得到0.5 g·mL-1紅景天提取液。取一定量的提取液，以1 mL·min-1速度上樣，上樣量為1.5倍柱體積，吸附1 h，以2 mL·min-1的洗脫速度依次用4倍柱體積的水、4倍柱體積的5%乙醇及11倍柱體積的20%乙醇進行洗脫，最后收集20%乙醇的洗脫液，蒸干，即得。

1.3.2 紅景天提取物類脂質體的制備

取處方量的Span 40、Span 80、膽固醇，加一定量的乙醇，超聲使其溶解，于65 ℃旋轉蒸發得到薄膜，加適量乙醇進行脫膜，得薄膜溶液，備用；取紅景天提取物，加PBS溶液（pH 7.4）超聲使其溶解，將薄膜溶液與其混合，超聲10 min，于60 ℃水合25 min，制得紅景天提取物類脂質體混懸液，通過高壓均質機，加乳糖適量攪拌使其溶解，按進口溫度120℃、進料速度180 mL/h、霧化壓力110 kPa、通風量為0.65 m3/min，噴霧干燥制備紅景天提取物類脂質體粉末。

1.3.3 紅景天提取物類脂質體包封率的測定

1.3.3.1 標準品溶液的制備

取約4.16 mg紅景天提取物對照品，精密稱定，置2 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升含2.08 mg的對照品溶液，即得。

1.3.3.2 色譜條件

以安捷倫Angilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈-水（10∶90，V/V）為流動相；檢測波長為275 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

1.3.3.3 包封率的測定與計算

取約0.5 g紅景天提取物類脂質體粉末，精密稱定，置10 mL量瓶中，加PBS溶液（pH 7.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，轉移至相對分子質量8 000～14 000的透析袋中，密封，置含120 mL PBS溶液（pH 7.4）的廣口瓶中，在（37±0.5）℃、轉速75 r/min條件下振蕩，于140 min精密量取外介質5 mL，蒸干，用甲醇溶解并稀釋至2 mL，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，作為包封率測定的供試品溶液，按“1.3.3.2”項下色譜條件進樣測定，計算包封率，包封率按式（1）計算。

式中：EE為包封率，%；C總為紅景天提取物總質量濃度，mg·mL-1；C游離為未包封的紅景天提取物質量濃度，mg·mL-1。

1.3.4 正交試驗與驗證試驗

根據單因素試驗結果，選擇HLB值（A）、表面活性劑與膽固醇比值（摩爾比）（B）、藥載比（C）、水合溫度（D）為影響因素，以包封率為考察指標，采用L9(34)正交試驗法優選紅景天提取物類脂質體工藝處方，因素水平設計見表1，將優選出的最佳處方及制備工藝進行驗證試驗。

表1 因素水平表

1.3.5 紅景天提取物類脂質體的表征

1.3.5.1 形態、粒徑及Zeta電位的測定

取紅景天提取物類脂質體混懸液，加適量雙蒸水稀釋，滴加在碳膜覆蓋的銅網上，自然晾干，再滴加1%磷鎢酸負染3 min，待晾干后置透射電鏡下觀察其形態。取紅景天提取物類脂質體混懸液適量，加適量雙蒸水稀釋，用激光粒度測定儀測定其粒徑及Zeta電位。

1.3.5.2 差示掃描量熱分析（Differential scanning calorimetric，DSC）

分別取紅景天提取物、膽固醇、甘露醇、物理混合物及紅景天提取物類脂質體粉末，置于鋁質坩堝中，測定條件為起始溫度25 ℃，終點溫度300 ℃，升溫速度10 ℃/min，保護氣體流量150 mL/min，感應器內N2流量50 mL/min。

2 結果與分析

2.1 正交試驗及驗證試驗

由表2和表3可知，影響類脂質體制備工藝的因素主次順序為A＞D＞C＞B；其中，HLB值和水合溫度對類脂質體制備工藝有顯著性影響（p＜0.05）。故確定最佳工藝為A2B3C2D2，即HLB值為6，表面活性劑與膽固醇的比值為1∶1，藥物與載體比值為1∶1，水合溫度為60 ℃，驗證試驗結果見表4，表明該工藝穩定可行。

2.2 紅景天提取物類脂質體的表征

2.2.1 形態、粒徑及 Zeta電位的測定

由圖1可知，紅景天提取物類脂質體在電鏡下為大小均勻的球形微粒。粒徑分布見圖2，紅景天提取物類脂質體的平均粒徑為661.7 nm，多分散指數（PDI）為0.360，Zeta電位為-19 mV。

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析表

表4 驗證試驗結果（n=3）

圖1 紅景天提取物類脂質體的透射電鏡圖（×75 000）

圖2 紅景天提取物類脂質體粒徑分布

2.2.2 差示掃描量熱分析

差示掃描量熱分析測定結果如圖3所示，紅景天提取物在121.25 ℃處有吸熱峰，甘露醇的熔點峰為166.86 ℃，膽固醇的熔點峰為150.15 ℃，當由三者制備成類脂質體后，只出現一個熔點峰，為204.15 ℃，且峰值發生變化，證明了類脂質體的形成。

圖3 膽固醇（A）、甘露醇（B）、紅景天提取物（C）、物理混合物（D）、類脂質體（E）的DSC圖譜

3 結論

前期研究過程發現，傳統薄膜分散法制備的類脂質體難包封率較低，原因主要是該方法水合需要的時間較長，易出現水合不完全的情況。故對該方法進行了改良，先將形成的類脂質體薄膜溶于乙醇后，再加入含藥的PBS溶液進行水合，這樣可大大增加薄膜在PBS溶液中的分散性，從而利于藥物的水合。此外，傳統薄膜分散法較難控制類脂質體的粒徑，因此采用改良的薄膜分散法制備紅景天提取物類脂質體混懸液后，再通過高壓均質機，可使類脂質體粒徑減小且均勻。采用改良的薄膜分散法制備紅景天提取物類脂質體，運用單因素考察法結合正交試驗對紅景天提取物類脂質體處方及工藝參數進行分析優化，得到的優化工藝簡單，穩定可行，為難溶性食品的研究提供參考。