肝再生過程中膽汁酸對肝細胞cyclin D1和NTCP蛋白表達的影響

董秀山，賀杰峰，趙浩亮(山西大醫院普通外科，太原 030032;通訊作者，E-mail:haoliangzhao@hotmail．com)

肝再生是臨床各種急慢性肝病和肝臟外科手術后重要的病理生理過程。維持正常的肝再生是修復肝損傷的必然機制，肝再生失調和重型肝炎、肝硬化以及肝癌等疾病的發生發展密不可分。因此，深入分析和闡述肝再生調控及影響機制，對治療臨床肝病具有非常重要的意義。前期的研究結果發現大鼠腸道膽汁酸缺乏使再生肝細胞的增殖細胞核抗原PCNA、Ki-67表達顯著下降，并伴隨血清總膽汁酸水平的下降和膽汁酸合成限速酶(CYP7A1)mRNA表達的升高［1］。提示膽汁酸是維持正常肝再生的重要內源性物質，CYP7A1的表達升高抑或為在肝再生過程中對機體缺乏膽汁酸的反應性調節。在此基礎上，本實驗重點觀察在肝再生過程中，腸道缺乏膽汁酸對肝細胞基膜側膽鹽攝取系統Na+依賴牛磺膽酸鈉協同轉運蛋白(NTCP)以及細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達的影響。

1 材料與方法

1．1 動物分組及模型建立

清潔級雄性Wistar大鼠72只(山西醫科大學動物實驗中心)，體重200-280 g，隨機分為3組。腸道膽酸缺乏組于術前7 d飼喂含2%無水考來烯胺飼料;膽酸負荷組于術前7 d飼喂含0．2%膽酸飼料;對照組飼喂標準飼料，每組根據處死模型大鼠的時間不同即6 h，12 h和24 h又分為三小組，每小組大鼠8只。所有大鼠均在乙醚麻醉下行70%(肝左葉+肝中葉)肝部分切除術(partial hepatectomy，PH)，建立肝再生大鼠動物模型。術后根據分組繼續給予相應飼料喂養，分別于6 h，12 h和24 h乙醚麻醉處死大鼠，收集肝臟標本于-80℃保存。

1．2 主要試劑和儀器

膽酸鈉(C24H40O5，408．58)，美國 Sigma 公司;無水考來烯胺，南京厚生藥業有限公司;兔抗NTCP抗體，美國ADL公司;兔抗大鼠cyclin D1抗體，北京博奧森生物技術有限公司;BCA試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，碧云天生物技術研究所;超聲粉碎儀，上海楚定分析儀器有限公司;低溫離心機，美國Beckman-Coulter公司;Tanon-2500凝膠成像系統，上海天能科技有限公司。

1．3 Western blot檢測cyclin D1和NTCP蛋白表達

按試劑操作說明書提取蛋白質，整個過程盡量在冰上進行。為了保證上樣量的均衡，用BCA試劑盒測定蛋白含量，然后加入適量樣品和Buffer在90℃變性20 min。取各組制備的蛋白樣品用10%SDS-PAGE分離，電轉移至PVDF膜上，并用麗春紅染色檢測轉移效果。封閉液37℃下孵育1 h，分別加兔抗大鼠cyclin D1抗體(1∶500)和兔抗NTCP抗體(1∶400)，4℃封閉過夜。TBST沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1 h，TBST沖洗，化學發光法顯色，洗片。凝膠成像分析系統分析條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算各組相應的灰度值比值。

1．4 統計學分析

2 結果

2．1 大鼠肝細胞cyclin D1蛋白表達的比較

通過比較三組大鼠在70%肝部分切除術后6 h cyclin D1相對表達量，發現膽酸缺乏組大鼠肝組織的表達量顯著低于對照組(P＜0．05)，而膽酸負荷組顯著高于對照組(P＜0．05)和膽酸缺乏組(P＜0．01)(見圖1)。在術后12 h時，膽酸缺乏組和對照組無統計學差異，但顯著低于負荷組(P＜0．05，見圖2)。

圖1 三組大鼠PH后6 h肝組織cyclin D1蛋白表達Figure 1 Expression of cyclin D1 protein in liver tissues at 6h after the operation

圖2 三組大鼠PH后12 h肝組織cyclin D1蛋白表達Figure 2 Expression of cyclin D1 protein in liver tissues at 12 h after the operation

2．2 肝部分切除術后24 h NTCP蛋白表達

前期研究顯示在術后24 h大鼠血清總膽汁酸和肝再生情況變化最為顯著。因此，檢測術后24 h肝細胞基膜側膽鹽攝取系統Na+依賴牛磺膽酸鈉協同轉運蛋白(NTCP)對肝再生時評估肝細胞對膽汁酸重吸收能力更具有意義。蛋白圖像分析的數據顯示(圖3)，膽酸缺乏組的NTCP蛋白相對表達量最高，膽酸負荷組NTCP的表達量最低，與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0．05)。

圖3 三組大鼠PH后24 h肝組織NTCP蛋白表達Figure 3 Expression of NTCP in liver tissues at 24 h after the operation

3 討論

一般認為，膽汁酸對脂類和脂溶性物質的消化吸收以及調節膽固醇代謝發揮著重要作用。然而，1999年膽汁酸受體(farnesoid X receptor，FXR)的發現使人們開始重新認識膽汁酸的生理作用，即膽汁酸在糖、脂和能量代謝等方面發揮著重要作用［2-4］。本課題前期研究發現適當增加體內膽汁酸含量顯著促進大鼠肝部分切除術(PH)后肝細胞DNA合成，反之則顯著抑制，且伴有肝細胞DNA合成的高峰延遲［1］。本實驗數據顯示70%PH后6 h，肝組織cyclin D1蛋白表達由高到低依次為膽酸負荷組、對照組和膽酸缺乏組(P＜0．05);70%PH后12 h，膽酸缺乏組和對照組的肝組織cyclin D1蛋白表達無統計學差異，但顯著低于膽酸負荷組(P＜0．05)，這些結果進一步說明膽汁酸在肝再生過程中發揮著重要作用。

究其機制，在過去10多年中，大量關于FXR功能的研究已經證實FXR是一種關鍵的代謝調節劑，主要調節膽汁酸內環境穩態、脂蛋白和葡萄糖代謝，認為FXR可能充當著代謝壓力的一般感應器和調節特定群組基因表達的調節器的角色從而達到保護肝臟的目的［5］。因此，膽汁酸作為肝臟的重要代謝產物，目前的研究結果不能完全詮釋膽汁酸調節肝再生的機制，其機制仍需進一步深入研究。

肝細胞是高度極性化的上皮細胞，肝細胞極性是肝臟獨特生理功能的基礎，是研究正常肝臟生理功能及肝再生過程中重要的物質結構。肝細胞極性主要由生理功能不同的基底側膜(血竇側)、頂端膜(膽管側)和側面膜構成。在肝再生過程中，肝細胞基膜側膽鹽攝取系統Na+依賴牛磺膽酸鈉協同轉運蛋白(NTCP)對調節肝細胞內膽汁酸發揮著重要作用［6］。本課題通過檢測PH后24 h肝組織NTCP蛋白表達，顯示膽酸缺乏組的NTCP蛋白相對表達量最高，而膽酸負荷組NTCP的表達量最低。這些可能是在肝再生過程中，體內對肝細胞缺乏膽汁酸的一種自我調節，通過上調NTCP來增加肝細胞內膽汁酸的含量。

事實上，再生肝細胞極性重建不是細胞增殖的后續效應，而是肝再生過程中不可分割的一部分。2011年Fu等［7］研究發現膽汁酸在肝細胞極性形成中發揮著一個新的重要作用，添加牛磺膽酸鈉促進大鼠肝細胞極性形成，提示膽汁酸可能是肝細胞極性紊亂的潛在治療物質。因此，進一步觀察膽汁酸和肝細胞極性形成的相互關系可能為研究肝再生和膽汁淤積肝病提供新思路。

［1］Dong X，Zhao H，Ma X，et al．Reduction in bile acid pool causes delayed liver regeneration accompanied by down-regulated expression of FXR and C-Jun mRNA in rats［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30(1):55-60．

［2］Parks DJ，Blanchard SG，Bledsoe RK，et al．Bile acids:natural ligands for an orphan nuclear receptor［J］．Science，1999，284(5418):1365-1368．

［3］Makishima M，Okamoto AY，Repa JJ，et al．Identification of a nuclear receptor for bile acids［J］．Science，1999，284(5418):1362-1365．

［4］Wang H，Chen J，Hollister K，et al．Endogenous bile acids are ligands for the nuclear receptor FXR/BAR［J］．Mol Cell，1999，3(5):543-553．

［5］Li T，Jahan A，Chiang JY．Bile acids and cytokines inhibit the human cholesterol 7 alpha-hydroxylase gene via the JNK/c-jun pathway in human liver cells［J］．Hepatology，2006，43(6):1202-1210．

［6］Attakpa ES，Djibril NM，Baba-Moussa F，et al．Expression and role of the genes involved in the transport of bile acids in the liver and kidneys in mice［J］．J Basic Clin Physiol Pharmacol，2013，24(2):97-103．

［7］Fu D，Wakabayashi Y，Lippincott-Schwartz J，et al．Bile acid stimulates hepatocyte polarization through a cAMP-Epac-MEK-LKB1-AMPK pathway［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(4):1403-1408．