雙歧桿菌插入失活載體的構建

崔 佳，萬翠香(長治醫學院微生物學教研室，長治 046000;南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室;通訊作者，E-mail:cuixiangwan@ncu．edu．cn)

插入突變是研究功能基因組學的一種重要方法，可為確定基因的功能提供最直接的證據［1］。本文應用的是質粒介導的插入突變，它是研究微生物功能基因組學的一種常用方法，其原理是將不能自主復制的自殺性質粒轉化入宿主，與宿主基因進行同源重組，達到對特定基因的改造或失活，進而開展基因功能的研究［2，3］。

自2006年雀巢公司發現在雙歧桿菌NCC2705中存在絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin(serine protease inhibitor)以來，先后在短雙歧桿菌210B中也發現Serpin蛋白［4］，然而關于Serpin蛋白在原核生物特別是在雙歧桿菌中的功能鮮見研究報道［5-7］。在本實驗室前期工作中，葉若松等［8］通過PCR擴增和Southern印跡雜交的方法發現B．bifidum WBBI02中存在serpin，將其連接入克隆載體pMD18-T和表達載體pET22b(+)，使serpin在大腸桿菌原核表達系統中表達，且進行了體外黏附功能研究。本實驗利用前期構建的質粒pMD18-T/serpin在serpin基因片段的SacⅡ酶切位點插入氯霉素抗性基因cmr，構建出雙歧桿菌pMD18-T/serpin-cmr插入失活質粒，為后續篩選雙歧桿菌serpin突變株逆向研究serpin功能做準備。

1 材料與方法

1．1 菌株與質粒

菌株:E．coli．DH5α(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏)。質粒:pMD18-T/serpin質粒(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室前期構建);pNZ44質粒(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏)

1．2 主要試劑與儀器

SacⅡ內切酶、CIAP去磷酸化酶均購自于TaKa-Ra大連寶生物有限公司;質粒提取試劑盒購自于北京全式金生物技術有限公司;PCR產物純化試劑盒購自于北京賽百盛基因技術有限公司;PCR儀:德國Eppendorf公司;離心機:德國Thermo公司;凝膠成像系統:美國Bio-Rad公司。

1．3 提取pMD18-T/serpin和pNZ44質粒，克隆氯霉素抗性基因cmr

采用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技術有限公司)提取pMD18-T/serpin和pNZ44質粒。根據已發表的氯霉素抗性基因序列，本實驗設計cmr基因引物，上游引物:GCCGCGGATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGAC(SacⅡ)和下游引物:GCCGCGGTTTTATAAAAGCCAGTCATTAG(SacⅡ)，對提取的pNZ44質粒的cmr基因進行PCR擴增。采用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并采用北京賽百盛基因技術有限公司的PCR產物純化試劑盒，對PCR產物進行回收純化。

1．4 單酶切pMD18-T/serpin和cmr，連接后篩選重組質粒pMD18-T/serpin-cmr

用SacⅡ對質粒pMD18-T/serpin進行單酶切，得到開環質粒，為防止質粒本身自連，單酶切后的質粒進行去磷酸化反應，將5＇-P轉化為5＇-OH，再按照去磷酸化體系∶樹脂=1∶1對去磷酸化后的質粒回收。同時將PCR擴增到的cmr產物也經SacⅡ酶切，酶切后回收并與pMD18-T-serpin載體進行連接，將連接體系轉入DH5α感受態細胞中，經菌落PCR驗證初步挑選出陽性克隆，再提取重組質粒pMD18-T/serpin-cmr，用SacⅡ作酶切驗證，驗證正確的質粒送往南京金斯瑞公司測序。

2 結果

2．1 pMD18-T/serpin質粒的提取和cmr的擴增結果

pMD18-T/serpin質粒提取后經瓊脂糖凝膠電泳后結果見圖1A;cmr擴增產物電泳后結果見圖1B;在750 bp左右可見目的基因片段，與預期結果相符。

圖1 pMD18-T/serpin質粒提取和PCR擴增cmr電泳圖譜Figure 1 Electrophoresis of the plasmids extraction of pMD18-T-serpin and PCR amplification of cmr

2．2 載體pMD18-T/serpin酶切去磷酸化后回收檢測

為了避免pMD18-T/serpin酶切后自連，將酶切回收后的pMD18-T/serpin磷酸化處理，0．5 h后樹脂回收去磷酸化產物，電泳檢測回收產物，結果顯示，在約3 000-4 000 bp之間可見目的基因條帶(見圖2)，與預期結果一致。

圖2 去磷酸化后回收電泳圖譜Figure 2 Electrophoresis of dephosphorylated products

2．3 菌落PCR驗證陽性克隆子

挑取轉化平板上的單菌落用cmr引物進行菌落PCR驗證，結果顯示，篩選的3個克隆在750 bp附近都擴增出了條帶(見圖3)，與目的基因cmr的片段長度相符合，電泳結果初步判定篩選到的菌落為陽性克隆。

圖3 菌落PCR電泳圖譜Figure 3 Electrophoresis of colony PCR

2．4 酶切驗證陽性克隆

菌落PCR驗證顯陽性的克隆再進行SacⅡ酶切驗證，電泳結果(圖4)顯示，1號泳道的克隆酶切到cmr基因，而2號泳道的克隆酶切驗證陰性。將1號泳道的陽性重組質粒測序，序列分析表明:克隆獲得的cmr基因片段為768 bp(見圖4)，與 GenBank中序列完全一致。

圖4 pMD18-T/serpin-cmr酶切鑒定電泳圖Figure 4 Electrophoresisofrecombinantplasmid pMD18-T/serpin-cmr digested by enzymes

3 討論

抗生素的廣泛使用，使得雙歧桿菌的抗藥性越來越多樣化。易發平等［9］研究報道，兩歧雙歧桿菌對氨基糖苷類和黃胺類抗生素具有抗性，而對氨芐類和氯霉素類抗生素敏感。而康小紅等［10］的研究顯示，雙歧桿菌對青霉素類、喹諾酮類抗生素也具有抗性，而對氯霉素類敏感。石晶紅［11］在對12株雙歧桿菌的藥敏性研究中發現，雙歧桿菌對氯霉素類抗生素敏感。因此，我們選擇以氯霉素類抗生素為標記構建插入失活載體，作為突變株的篩選標記。

功能基因組研究的一個重要內容是突變體的構建，這是因為突變體和相應的突變基因間有著直接的因果關系［12］，構建突變體庫的方法有物理和化學誘變、基因沉默、基因敲除以及插入突變等。插入突變與其他方法相比具有很多優點，該方法利用已知的插入序列作為標記基因，直接可對未知基因進行反向研究，不必事先確定基因表達和基因產物［1，13］，且插入突變具有操作簡便、快捷的特點。因此，在功能基因組學研究中插入突變已成為基因初步鑒定及功能研究的首選方法［14，15］。利用插入突變進行功能基因組學研究時主要采用T-DNA、轉座子及質粒介導的插入突變等方法構建突變庫［16］，本研究即采用質粒介導的插入突變方法試圖對長雙歧桿菌中Serpin進行功能失活的研究。實驗中我們成功構建了雙歧桿菌serpin基因的插入失活載體pMD18-T/serpin-cmr，為后續通過同源重組獲得serpin突變株提供了打靶載體，進而對逆向探究雙歧桿菌Serpin蛋白的黏附功能改變奠定了工作基礎［17-19］。

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