白芍總苷對EAE大鼠外周免疫器官及中樞神經系統NF-κB p65表達的影響

李世舉，王艷旭，吳松鷹，吳成翰，王謹敏(福建中醫藥大學附屬第二人民醫院腦病科，福州 350003;福建中醫藥大學附屬人民醫院腦病科;通訊作者，E-mail:4767086@qq．com)

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是神經內科常見的一種自身免疫性疾病，病殘率高。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國際公認的 MS的動物模型，可以用于評價藥物對MS的治療作用，并探索其治療機制。NF-κB作為重要的核轉錄因子，是炎癥反應的總開關之一，與免疫細胞的增殖、活化和凋亡密切相關，在MS及EAE發病及病情發展中起關鍵作用［1］。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)為白芍中提取的有效成分，具有多途徑抑制自身免疫反應的藥理作用［2］。國內目前已開展TGP治療EAE 的研究［3，4］，并取得良好療效，但目前尚未見TGP對EAE外周免疫器官及中樞神經系統NF-κB p65影響的研究。本研究采用TGP預防性治療EAE大鼠，觀察TGP對EAE大鼠外周免疫器官及中樞神經系統NF-κB p65表達的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

6-8周健康清潔雄性Lewis大鼠60只，體質量150-180 g，動物由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號:SCXK(滬)2012-0002。雌性豚鼠13只，體質量450 g到500 g，由上海市松江區松聯實驗動物場提供，動物許可證號:SCXK(滬)2012-0011。

1．2 白芍總苷及主要試劑

白芍總苷膠囊，三九醫藥股份有限公司生產(批號:110904，以白芍總苷計 0．3 g/粒);NF-κB p65一抗(美國Santa Cruz公司);二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);DAB顯色系統試劑盒、BCIP/NBT顯色液、核快紅復染液(福州邁新生物技術開發公司);蘇木精、伊紅染色劑(北京經科化學試劑經營公司);弗氏完全佐劑(美國Sigma公司，含滅活結核桿菌1 mg/ml);百日咳疫苗(Bordetella Pertussis Vaccine，BPV)由上海生物制品研究所提供;滅活牛型結核桿菌由上海生物制品研究所提供(1 ml約含100 mg)。

1．3 大鼠分組及EAE模型的建立

大鼠采用隨機數字法分為對照組(n=10)、模型組(n=25)、TGP組(n=25)。無菌條件下取豚鼠脊髓勻漿，先將與該勻漿液等體積的弗氏完全佐劑與滅活結核桿菌混合，使其成為含6 mg/ml的弗氏完全佐劑。在冰浴條件下使兩者充分研磨形成誘導乳劑。TGP組及模型組大鼠后肢足掌皮內注射誘導乳劑，共0．4 ml/只。每只大鼠背部皮下注射0．1 ml BPV。對照組以等量PBS代替豚鼠脊髓勻漿，余同其他組。

1．4 藥物干預

按照藥理學實驗動物劑量換算公式，根據人類TGP的常用劑量來換算大鼠的劑量，采取0．2 g/(kg·d)的劑量。白芍總苷藥片溶于于生理鹽水溶液中制成懸濁液。TGP組的大鼠，從免疫第1天起(免疫當天記為第1天)，每天經口灌服白芍總苷懸濁液0．2 g/kg。對照組及模型組給予同體積生理鹽水。

1．5 臨床觀察

常規飼養三組大鼠，自免疫后第1天起，由同一人同一時間段單盲觀察發病情況，行臨床神經功能評分。臨床神經功能評分采用5分法［5］:0分，無任何體征;1分，尾部無力;2分，后肢無力;3分，雙后肢完全癱瘓;4分，前后肢癱瘓;5分，瀕死狀態或死亡。以大鼠達到或超過1分為臨床EAE發病。大鼠每日的平均臨床神經功能評分，分別由當日臨床積分總和除以該組大鼠的數目獲得。

1．6 組織切片的制備

大鼠在免疫后第14天，麻醉后經升主動脈灌注生理鹽水250 ml，繼以含4%多聚甲醛0．1 mol/L PBS液300 ml灌注后，取腦、脊髓、脾及淋巴結置于10%的甲醛中固定18 h。石蠟包埋，制4 μm厚切片。

1．7 病理學檢查

常規HE染色，每只動物中樞神經各取4張切片(大腦視交叉水平、腦干、頸膨大、腰膨大各隨機取1張切片)，光學顯微鏡下觀察，計算炎癥浸潤細胞數目，把各節段炎癥浸潤細胞數相加作為該只大鼠的總的炎癥浸潤細胞數。

1．8 免疫組化檢測NF-κB p65

采用二步法，DAB顯色，蘇木素復染，NF-κB p65(1∶100)，以0．01 mol/L PBS 代替一抗作陰性對照。具體步驟:石蠟切片常規脫蠟、水化，ddH2O沖洗，抗原微波修復，PBS沖洗，滴加3%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS沖洗，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，ddH2O及流水沖洗，蘇木素復染，ddH2O沖洗，0．5%鹽酸酒精分化，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯中透明，封片。每只動物中樞神經系統各取4張切片(大腦視交叉水平、腦干、頸膨大、腰膨大各隨機取1張切片)，脾及淋巴結隨機各取3張切片，光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機取5個不重疊的高倍視野(×400)。胞質及(或)胞核出現淺黃色-黃褐色者為NF-κB p65陽性細胞。

用數字顯微攝影系統拍照，用Image-Pro Plus 5．0圖像分析軟件，測定每個高倍視野下陽性細胞的積分光密度(integral optical desity，IOD)值。取均數作為該只大鼠的中樞神經系統、脾及淋巴結的NF-κB p65的IOD值。

1．9 統計學分析

采用SPSS 20．0軟件處理。發病率用Fisher確切概率法檢驗。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0．05為差異有統計學意義(發病率兩兩比較檢驗水準經Bonferroni校正，以P＜0．012 5為差異有統計學意義)。

2 結果

2．1 動物臨床表現

對照組大鼠不發病，模型組發病率為100%，TGP組發病率96%。模型組和TGP組大鼠于免疫后8 d開始發病，逐漸出現尾巴、后肢和前肢無力乃至癱瘓，食欲下降，毛發失去光澤，重者伴大小便失禁，免疫后第12天平均神經功能評分達到高峰。發病率三組間比較差異有統計學意義(P＜0．05)。進一步兩兩比較，模型組發病率與TGP組比較差異無統計學意義(P＞0．012 5)，模型組發病率與對照組比較差異有統計學意義(P＜0．012 5)，TGP組發病率與對照組比較差異有統計學意義(P＜0．012 5)。TGP組發病潛伏期比模型組長，差異有統計學意義(P＜0．05)。TGP組臨床神經功能評分最高值比模型組明顯降低，差異有統計學意義(P＜0．05，見表1)。

2．2 動物病理學改變

發病的大鼠腦及脊髓可見多發炎性細胞浸潤，從形態上看，炎性細胞多為淋巴細胞、巨噬細胞。部分小血管管周有大量炎性細胞浸潤，形成“袖套”狀改變，還可以見到淋巴細胞結節形成。病灶多位于白質，灰質也出現少量上述病變，但程度較輕。TGP組炎癥浸潤細胞比模型組少，兩組比較差異有統計學意義(P＜0．05)。對照組大鼠腦及脊髓病理檢查未見異常(見表1、圖1)。

表1 大鼠臨床評估及病理改變Table 1 Clinical assessment and pathological changes in rats

圖1 三組大鼠脊髓病理改變(HE染色，×400)Figure 1 The pathological changes of spinal cord in three groups(HE，×400)

2．3 NF-κB p65 的表達

對照組腦及脊髓有極少量NF-κB p65蛋白陽性細胞，散在分布，從形態上判斷，為神經膠質細胞、神經元、內皮細胞。模型組可見腦及脊髓大量的NF-κB p65蛋白陽性細胞，散在分布，以白質區居多，從形態上判斷，神經膠質細胞、神經元、內皮細胞及炎癥浸潤細胞均有NF-κB p65的表達，但以炎癥浸潤細胞特別是血管周圍炎癥浸潤細胞高表達NF-κB p65為主，部分NF-κB p65蛋白核轉移，提示 NF-κB的活化，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0．05)。TGP組腦及脊髓NF-κB p65蛋白的表達較對照組高，但較模型組低，差異有統計學意義(P＜0．05)。三組大鼠淋巴結及脾均有NF-κB p65蛋白陽性細胞。模型組脾及淋巴結NF-κB p65蛋白的表達高于對照組及TGP組，差異有統計學意義(P＜0．05)。TGP組脾及淋巴結NF-κB p65蛋白的表達高于對照組，差異有統計學意義(P＜0．05，見表2，圖2-4)。

表2 大鼠外周免疫器官及中樞神經系統NF-κB p65蛋白的IODTable 2 The IOD of NF-κB p65 protein in the peripheral immune organs and CNS in rats

圖2 三組大鼠脊髓NF-κB p65的表達(DAB顯色，蘇木素復染，×400)Figure 2 The protein expression of NF-κB p65 in spinal cord in three groups(DAB coloration，hematoxylin re-staining，×400)

圖3 三組大鼠脾NF-κB p65的表達(DAB顯色，蘇木素復染，×400)Figure 3 The protein expression of NF-κB p65 protein in spleen in three groups(DAB coloration，hematoxylin re-staining，×400)

3 討論

MS的發病機制包括外周自身反應性淋巴細胞(主要是T細胞)的活化增殖，血腦屏障的破壞，自身反應性淋巴細胞進入中樞神經系統，啟動炎癥反應并進一步破壞血腦屏障，進一步募集抗原特異的淋巴細胞進入中樞神經系統，促使其他炎癥細胞和效應分子如巨噬細胞浸潤到中樞神經系統［6，7］。脾及淋巴結是主要的外周免疫器官，外周免疫器官在自身免疫性疾病的發生發展過程中起著重要的作用［7，8］。目前認為抗原特異的淋巴細胞激活后在外周免疫器官不斷增殖，然后不斷釋放入血液及淋巴循環中，是MS患者中樞神經系統活化的淋巴細胞的主要來源［7，8］。

NF-κB是最為重要的核轉錄因子之一，廣泛參與了多種基因的表達調控，其中包括多種與免疫反應密切相關的細胞因子和黏附分子，是免疫反應的總開關之一。NF-κB引起的信號級聯反應在MS和EAE發病及病情進展中起著關鍵作用。NF-κB能促進T細胞向Th1細胞及Th17細胞分化，上調TNF-α、IL-1、IL-2、IFN-γ、GM-CSF 等炎性因子及 VCAM-1、ICAM-1等細胞黏附分子的表達，加重EAE臨床癥狀［1］。NF-κB的表達及活化對外周及中樞神經系統自身反應性淋巴細胞的活化與增殖是必須的，選擇性NF-κB 抑制劑能減輕 EAE 病情［1］。NF-κB p65 亞基是NF-κB最重要的具有轉錄活性的亞基。

TGP在目前的臨床用藥劑量下具有多途徑抑制自身免疫反應的藥理作用，對多種自身免疫性疾病的治療取得良好效果［2］。研究表明 TGP能抑制NF-κB 蛋白的表達與活化［2，9］，這對 EAE 或 MS 的治療具有重要意義。徐曉婭等［4］的研究表明，TGP能降低EAE大鼠血清IFN-γ、TNF-α的水平，這可能是通過抑制NF-κB來實現的。

在本實驗中，TGP組與模型組比較，TGP組的發病潛伏期延長(P＜0．05)，神經功能評分降低(P＜0．05)，中樞神經系統炎癥浸潤細胞減少(P＜0．05)，臨床與病理均表明該藥對EAE的確有治療作用。通過本實驗，我們發現模型組大鼠的淋巴結及脾NF-κB p65的表達比對照組高(P ＜0．05)，說明EAE大鼠淋巴結及脾NF-κB p65的表達上調。NF-κB表達上調能促進T細胞向Th1細胞及Th17細胞分化，促進淋巴結及脾自身反應性淋巴細胞的進一步活化與增殖［1］，進而進入中樞神經系統的自身反應性淋巴細胞增多，加重EAE的病情。TGP組淋巴結及脾 NF-κB p65的表達較模型組低(P＜0．05)，表明TGP能抑制 EAE大鼠的淋巴結及脾NF-κB p65的表達，從而減輕自身反應性淋巴細胞的進一步活化與增殖，有利于減輕EAE的病情。TGP組淋巴結及脾NF-κB p65的表達較對照組高(P＜0．05)，說明TGP尚不能完全抑制淋巴結及脾NF-κB p65的表達，僅能部分抑制淋巴結及脾NF-κB p65的表達。對照組腦與脊髓NF-κB p65的表達極少，模型組腦與脊髓高表達NF-κB p65，主要位于血管周圍的炎癥浸潤細胞，部分NF-κB p65蛋白核轉移，提示NF-κB處于激活狀態，這與國內外的實驗結果［1，10］一致。目前的研究［1］表明中樞神經系統 NF-κB的表達及活化能使EAE的病情加重。在本實驗中，TGP組腦與脊髓 NF-κB p65的表達比模型組低(P＜0．05)，說明TGP能抑制EAE大鼠中樞神經系統NF-κB p65的表達，從而減輕EAE的病情。綜上，我們推測TGP治療EAE的部分機制可能是通過抑制外周免疫器官NF-κB表達，從而減少外周免疫器官內自身反應性淋巴細胞的活化增殖，減少進入淋巴系統及血循環中自身反應性淋巴細胞的數量，進而減少自身反應性淋巴細胞進入中樞神經系統的數量，減輕EAE大鼠中樞神經系統炎癥細胞的浸潤;在中樞神經系統，TGP可抑制NF-κB的表達，從而抑制已活化的炎癥浸潤淋巴細胞的進一步增殖及淋巴細胞在中樞神經系統的進一步募集，減輕EAE大鼠中樞神經系統炎癥細胞的浸潤程度，并在轉錄水平減少炎性細胞因子及黏附分子的分泌，抑制了NF-κB介導的炎癥反應，切斷了其后的一系列炎癥脫髓鞘過程，進而減輕了EAE的病情。

總之，TGP對EAE的治療是有效的，其機制之一可能是通過抑制外周免疫器官及中樞神經系統NF-κB p65的表達，從而抑制外周免疫器官及中樞神經系統自身反應性淋巴細胞的活化、增殖，抑制了NF-κB介導的炎癥反應，減輕EAE的病情。當然，TGP治療MS還只處于動物實驗研究階段，其治療機制有待進一步研究。TGP作為一種成熟的中成藥，其副作用少，價格不高，相信隨著研究的深入，在MS的治療中應該有較大的作為。

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