苦參堿對宮頸癌HeLa細胞黏附和侵襲的抑制作用及其機制

張 悅，符喬珊(西安市第四醫院婦產科，西安 710075)

在發達國家Pap涂片的廣泛應用降低了宮頸癌的發病率，但是在發展中國家，宮頸癌仍然位于女性腫瘤致死病因的第一位。遠處轉移是導致宮頸癌患者死亡的主要原因，同時也是宮頸癌治療的困難所在。開發有效的抗宮頸癌侵襲轉移新藥，對于減少宮頸癌的復發轉移，改善宮頸癌的總體治療效果，提高宮頸癌患者的生存率意義重大，已成為宮頸癌治療領域的熱點。中藥因其低毒性、多水平、多靶點和多作用互相協調的特點，近年來已成為抗宮頸癌藥物研究的熱點之一，越來越受到人們的重視和青睞。苦參作為一種常用的中草藥在我國已經有上千年的使用歷史，被認為具有對腫瘤、病毒性肝癌和心臟疾病的治療作用。苦參堿是從中藥苦參中提取的一種單體成分［1］。既往研究發現苦參堿能夠有效抑制結腸癌和乳腺癌細胞的侵襲轉移［2，3］，但是其對宮頸癌細胞侵襲轉移的作用，至今仍鮮見文獻報道。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及苦參堿溶液

苦參堿購于美國Sigma公司，Transwell小室購于美國Corning公司。MTT細胞增殖及活性檢測試劑、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、DMSO、Trypsin-EDTA溶液、蛋白分子量標記、細胞裂解液、HRP標記的羊抗兔IgG(H+L)抗體和PVDF膜購于上海碧云天生物技術有限公司。CollagenⅠ購于Bio-Rad公司。兔抗人 MMP-2、MMP-9、p38和 p-p38購于 Cell Signal公司，GADPH購于Santa Crus公司。

利用100%DMSO配制苦參堿母液，原液濃度為60 mg/ml，儲存溫度為4℃。所有試驗中用藥均采用RPMI1640培養基現用現配的方法，所有培養液中DMSO的終濃度均小于0．1%。

1．2 細胞培養

宮頸癌HeLa細胞系為本實驗室保有。細胞培養液為含有10%血清的RPMI1640培養基，培養基中含有100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。細胞在溫度為37℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養，每2-3 d換液一次，細胞融合率達到70%-80%時進行傳代培養。

1．3 MTT 試驗

本研究利用MTT試驗檢測苦參堿對HeLa細胞增殖的影響，取對數生長期的HeLa細胞，配成濃度為5×104個/ml懸液接種于96孔板中，每孔接種量為100 μl。細胞貼壁培養6 h后，利用含有苦參堿藥物的溶液培養細胞24 h，藥物濃度為(0．2，0．4，0．6，0．8，1．0 和 1．5 g/L)或 10 μl RPMI1640(對照組)。其后96孔板中每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，然后置于37℃環境中培養4 h。在加入DMSO后于酶標儀中選取570 nm進行讀數。抑制率計算公式為:抑制率(IR)=(1-治療組OD/對照組OD)×100%。

1．4 細胞黏附試驗

96 孔板中每孔加入 50 μl Collagen Ⅰ(20 μg/ml)，37℃孵育1 h，其后用含有20 g/L BSA的RPMI1640培養基37℃封閉30 min。苦參堿(0，0．05，0．1，0．2，0．4，0．6 和 0．8 g/L)處理 HeLa 細胞 24 h后，胰酶消化后用RPMI1640培養基稀釋成濃度為8×105細胞/ml的細胞懸液，然后接種于96孔板中，每孔100 μl。37℃培養1 h后，PBS洗滌2次，加入50 μl MTT并37℃孵育4 h，吸棄MTT加入 DMSO 200 μl。酶標儀570 nm波長讀取OD值。

1．5 細胞侵襲試驗

取對數生長期HeLa細胞，胰酶常規消化后利用血清濃度為2%的培養基制成5×105細胞/ml的細胞懸液，在Tranwell小室上室中加入含有不同濃度黃芩素的細胞懸液0．4 ml，下室中加入血清濃度為10%的常規培養基。24 h后取出小室對細胞進行固定，用棉簽去除上室中殘留細胞并對小室底部的細胞進行固定、染色和拍照，并在顯微鏡下進行計數。

1．6 實時定量PCR檢測苦參堿對MMP-2和MMP-9轉錄的影響

Trizol法提取各組細胞中總RNA，根據TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說明書進行反轉錄cDNA。以cDNA為模板進行real-time PCR反應并對結果進行分析，引物設計見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Gene-specific primer pairs used for real-time PCR

1．7 免疫印跡試驗

苦參堿處理HeLa細胞24 h，常規消化細胞后冰PBS洗滌兩次，加入裂解液裂解細胞，離心提取蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，并根據蛋白提取物濃度確定上樣量。每次試驗之前將蛋白煮沸變性、然后在SDS凝膠中每孔加入等量蛋白，根據目的蛋白的分子量調整電泳時間和電壓，電泳結束后轉膜，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。根據抗體說明書配置一抗濃度，然后將膜封閉于含有各種抗體的溶液中，4℃搖床過夜。次日PBST洗膜三次，然后常溫封閉相應二抗1 h、再次用PBST洗滌三次，最后一次用PBS洗滌，洗滌時間均為15 min。最后利用成像系統對結果圖像進行采集，并對數據進行分析。

1．8 統計學分析

2 結果

2．1 苦參堿對HeLa細胞增殖的抑制作用

本研究發現苦參堿能夠明顯抑制HeLa細胞的增殖，隨著苦參堿濃度的升高，其對HeLa細胞增殖的抑制作用逐漸增強，當濃度達到0．8 g/L時出現統計學差異(P ＜0．05，見圖1)。

2．2 苦參堿對HeLa細胞黏附能力的影響

為了檢驗苦參堿對HeLa細胞黏附能力的影響，我們將HeLa細胞接種于包被有CollagenⅠ的96孔板中，其后用不同濃度苦參堿(0．05，0．1，0．2，0．4，0．4，0．6和0．8 g/L)對細胞進行干預。結果顯示，隨著苦參堿濃度的增加細胞的黏附能力逐漸降低，當苦參堿的濃度達到0．4 g/L時差異出現統計學意義(P ＜0．05，見圖2)。

圖1 苦參堿對HeLa細胞增殖的抑制作用Figure 1 The inhibition effect of matrine on the proliferation of HeLa cells

2．3 苦參堿對HeLa細胞侵襲能力的影響

本研究前期試驗結果顯示，在濃度高于0．8 g/L時，苦參堿能夠明顯抑制HeLa細胞的增殖。為此我們選擇低于0．8 g/L濃度的苦參堿作為檢測其抗侵襲能力的實驗濃度，以消除其抗增殖能力對試驗結果的影響。Transwell小室的結果顯示在低于細胞毒性濃度的情況下，苦參堿能夠明顯抑制HeLa細胞的侵襲(P ＜0．05，見圖3)。

圖2 苦參堿對HeLa細胞黏附能力的抑制作用Figure 2 The inhibition effect of matrine on the adhesion of HeLa cells

圖3 苦參堿對HeLa細胞侵襲轉移能力的影響Figure 3 The inhibition effect of matrine on the invasion of HeLa cells

2．4 苦參堿對MMP-2和MMP-9的轉錄的影響

為了進一步探討苦參堿抑制HeLa細胞侵襲轉移的機制，我們利用real-time PCR技術檢測了苦參堿對MMP-2和MMP-9 mRNA轉錄的影響，結果發現苦參堿能夠在mRNA水平明顯抑制MMP-2和MMP-9的轉錄，差異具有統計學意義(P＜0．05，見圖4)。

2．5 苦參堿對MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的影響

圖4 苦參堿對HeLa細胞中MMP-2和MMP-9轉錄的影響Figure 4 The effect of matrine on the expression of MMP-2 and MMP-9 at mRNA level in HeLa cells

同2．4我們檢測了苦參堿對HeLa細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平的影響，結果發現，苦參堿能夠明顯抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平，這種作用隨著苦參堿濃度的升高明顯增強，差異具有統計學意義(P＜0．05，見圖5)。

圖5 苦參堿對MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的影響Figure 5 The effect of matrine on the expression of MMP-2 and MMP-9 at protein level in HeLa cells

2．6 苦參堿對p38磷酸化水平的影響

進一步檢測苦參堿對p38信號通路活性的影響，結果發現，苦參堿能夠明顯抑制p38信號通路的活性。隨著苦參堿濃度的升高p38的磷酸化水平明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0．05，見圖5)。

圖6 苦參堿對p38信號通路活性的影響Figure 6 The effect of matrine on the activity of p38 signal pathway

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，隨著宮頸細胞學掃描和早期診斷的發展，其發病率和死亡率在過去40年中顯著下降［4，5］。宮頸癌臨床早期階段，多采用子宮切除或初級放療的治療方法，然而很多病例在確診時已經發展到晚期階段，其中大約35%為區域轉移、10%為遠距轉移。雖然近年來輔助化療和放療技術有了顯著發展，但宮頸癌的1年復發率仍然為50%，2年復發率為35%-80%。

本研究的結果顯示，苦參堿能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖，且低于細胞毒性濃度的苦參堿能夠有效降低宮頸癌細胞的黏附和侵襲能力，提示苦參堿很有可能會成為一種有效的抗宮頸癌侵襲轉移藥物。在腫瘤突破基質過程中，基質金屬蛋白酶等分子發揮著重要的作用。基質金屬蛋白酶是一組進化上高度保守的鋅離子依賴蛋白水解酶，它可降解上皮細胞基底膜或細胞外基質，在腫瘤突破基底膜以及細胞基質的過程中發揮重要的作用。MMP-2又稱明膠酶A，在惡性程度高的腫瘤組織中呈高表達［6］，腫瘤細胞可分泌MMP-2特異性降解細胞基底膜及細胞外基質中的明膠和纖維蛋白等成分，最終導致基底膜破壞和腫瘤細胞的侵潤。研究發現抑制MMP-2的表達能夠降低宮頸癌細胞侵襲轉移能力［7］。MMP-9又稱明膠酶B，也具有降解明膠，Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原以及彈力纖維的能力，它可降解完整的基底膜。研究發現MMP-9與宮頸癌的侵襲轉移密切相關［8］。總之，MMP-2和MMP-9在宮頸癌的侵襲轉移過程中發揮重要作用，阻斷或者降低二者的表達必然能夠減少宮頸癌侵襲轉移的發生［9］，而本研究的結果顯示苦參堿能夠有效降低MMP-2和MMP-9的轉錄與表達，這提示苦參堿的抗宮頸癌細胞侵襲轉移作用，可能與其對二者表達的抑制相關。

p38信號通路在宮頸癌細胞增殖、凋亡中發揮重要作用。既往研究發現p38信號通路能夠有效活化下游多種靶點的表達與活化，其中就包括MMP-2和 MMP-9［10，11］。此外，p38 信號通路能夠通過調節MMP-9啟動子位點的活性調節MMP-9的表達，從而進一步調節細胞的侵襲轉移［12］。在本研究中我們發現，苦參堿能夠降低HeLa細胞中p38的磷酸化水平，提示其對HeLa細胞侵襲轉移的抑制作用可能是通過對p38信號通路活性的調節實現的。

綜上，苦參堿對宮頸癌侵襲轉移的抑制作用，可能是通過抑制p38信號通路的活性進一步抑制MMP-2和MMP-9的表達實現的。本研究的結果提示，苦參堿具有明確的抗宮頸癌侵襲轉移作用，提示苦參堿有望成為一種有效的抗宮頸癌細胞侵襲轉移藥物，為宮頸癌的治療帶來新的曙光。

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