Wnt信號通路中GSK-3β和CD44v6在人結直腸腫瘤組織中的表達及意義

吳紅霞，鄭繪霞，梁建芳(山西醫科大學第二醫院西院病理科，太原 03000;山西醫科大學第一臨床醫學院病理科;通訊作者，E-mail:liangjianfang000@63．com)

Wnt信號通路異常激活在結直腸癌(colorectal cancer，CRC)中被確認為是與腫瘤相關的一個關鍵性信號通路，大約90%的結直腸癌存在Wnt信號通路的異常激活，Wnt信號通路過度激活也常引起腫瘤侵襲轉移能力的增強［1，2］。GSK-3β 為 Wnt信號通路中重要的負向調節因素，黏附分子CD44v6是Wnt信號通路突出的靶基因，本文通過研究二者在結直腸癌中的表達情況，探討GSK-3β及CD44v6在結直腸癌發生發展中的的作用及二者相互作用關系，為臨床預后及治療提供一定的依據。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

選擇山西醫科大學第二醫院西院病理科2014-01～2015-07間的石蠟包埋標本，包括20例正常結直腸腸黏膜、19例結直腸腺瘤和45例結直腸腺癌。正常腸黏膜組均為距腫瘤大于5 cm的切緣正常組織，男性10例，女性10例，年齡22-82歲，中位數65歲。腺瘤組，男性12例，女性7例，年齡30-80歲，中位數50歲。結直腸腺癌組，男性21例，女性24例，年齡22-82歲，中位數66．5歲。所有入選病例術前均未做過放、化療。所有標本重新切片，HE染色形態學符合結直腸腺瘤與腺癌的特點。

1．2 實驗方法

采用免疫組織化學EnVision兩步法，鼠抗人GSK-3β多克隆抗體試劑購自Santa cruz biotechnology，Inc，鼠抗人CD44v6單克隆抗體試劑購自北京中杉金橋生物科技有限公司，DAB顯色試劑購自福州邁新生物技術有限公司，用已知陽性的切片作陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照，實驗步驟按試劑說明書進行。

1．3 免疫組化判定標準

GSK-3β以細胞胞質出現棕黃色顆粒為陽性，CD44v6陽性表達定位于胞膜。免疫組化判讀:隨機選擇10個高倍鏡(400倍)視野，每個視野計數100個細胞，以陽性細胞比率(無著色為0分，＜1/3為1分，1/3-2/3為2分，＞2/3為3分)與染色強度(無著色、黃色、棕黃和棕褐色分別為0，1，2，3分)的乘積綜合判斷，0-4分為陰性(-)，5-7分為陽性(+)，8-10分為強陽性(++)。

1．4 統計學分析

所有資料均采用SPSS11．5統計軟件包進行分析，組間比較及各指標臨床病理參數的比較采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 GSK-3β在各組織中的表達情況

正常結直腸黏膜中GSK-3β表達陽性率5．0%(1/20)，腺瘤中 GSK-3β表達陽性率42．1%(8/19)，CRC中GSK-3β表達陽性率77．8%(35/45)。CRC組GSK-3β表達顯著高于腺瘤組和正常黏膜組，差異有顯著性(P ＜0．05，見表1)。

CRC組GSK-3β表達與Dukes分期、分化程度、有無淋巴結轉移均無關(P＞0．05，見表2，圖1)。

2．2 CD44v6在各組織中的表達情況

CD44v6在正常黏膜及腺瘤組織中均不表達，陽性率為0。在CRC中陽性率為55．6%(25/45，見圖2)。CRC組CD44v6的表達顯著高于腺瘤組和正常黏膜組，差異具有統計學意義(P＜0．05，見表1)。

在CRC組中，CD44v6的表達與Dukes分期、淋巴結轉移相關(P＜0．05)，而與分化程度無關(P＞0．05，見表2，圖2)。

表1 GSK-3β和CD44v6在結直腸正常黏膜、腺瘤及CRC中的表達 (例)Table 1 The expression of GSK-3β and CD44v6 protein in the normal intestinal mucosa，colorectal adenomas and colorectal carcinoma (cases)

圖1 GSK-3β在結直腸腺癌、腺瘤及正常腸黏膜的表達 (EnVision，×200)Figure 1 GSK-3β protein expression in the colorectal carcinoma，colorectal adenomas and normal intestinal mucosa(EnVision method，×200)

表2 GSK-3β和CD44v6在CRC中的表達與臨床病理參數的關系Table 2 Relationship of GSK-3β and CD44v6 protein expression with clinicopathological characteristics in colorectal carcinoma

圖2 CD44v6在結直腸腺癌、腺瘤及正常腸黏膜的表達 (EnVision，×200)Figure 2 CD44v6 protein expression in colorectal carcinoma，colorectal adenomas and normal intestinal mucosa(EnVision method，×200)

2．3 GSK-3β和CD44v6在CRC中表達的相關性

GSK-3β與CD44v6在CRC中表達共同陽性21例，共同陰性6例，經Spearman秩相關分析二者表達無相關性(r=0．167，P ＞0．05，見表 3)。

表3 CD44v6和GSK-3β表達在CRC中的相關性分析Table 3 Correlation analysis of GSK-3β and CD44v6 protein expression in colorectal carcinoma

3 討論

CRC是全球人類主要的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。目前認為CRC發生的機制有四種:經腺瘤癌變通路，鋸齒狀病變通路，潰瘍性結腸炎相關的大腸癌通路及幼年性息肉病-癌途徑。其中經腺瘤癌變途徑的散發性CRC多認為與Wnt信號通路異常激活有關。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是Wnt信號通路中重要的負向調節因子。GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，人類多種疾病如糖尿病、腫瘤、神經退行性疾病、情感障礙和炎癥等疾病的發生都與GSK-3β活性調節異常有關，在許多腫瘤組織中呈高表達［3-5］。GSK-3β作為Wnt信號通路中 APC-β-catenin-GSK-3β-Axin多聚蛋白復合體的重要一份子，是Wnt信號通路的負向調節因素，可磷酸化β-catenin的絲氨酸和蘇氨酸位點，促使βcatenin的降解;亦可經Axin磷酸化APC，磷酸化的APC會增加其與β-catenin的結合，繼而降解β-catenin，從而使Wnt信號通路保持沉默。GSK-3β也可直接調節β-catenin目的基因cyclin D1的降解，影響細胞的增殖［6］。在我們研究的45例 CRC中，GSK-3β在三組病例中的表達，無論是陽性病例數還是強陽性病例數都是正常黏膜→腺瘤→癌顯著增高，意味著GSK-3β參與正常黏膜→瘤變→癌變通路，參與了CRC的發生，影響細胞的增殖和分化。在食管癌中，GSK-3β在組織中的表達明顯高于正常食管上皮及非典型增生病變，但與臨床病理參數如腫瘤分級、浸潤深度及淋巴結轉移均無關［7］，但在子宮內膜癌中，GSK-3β在癌組織中的表達明顯高于正常內膜組織，且與臨床病理參數腫瘤分級、分期，肌層浸潤程度及淋巴結轉移相關，其過表達與子宮內膜癌的發生發展及轉移密切相關［8］。

我們的研究顯示，GSK-3β在CRC中表達與臨床病理參數的Dukes分期、分化程度、淋巴結有無轉移均不相關，表明GSK-3β在參與腫瘤細胞的增殖方面有一定的作用，但與腫瘤的浸潤轉移無明顯相關性，即與腫瘤的惡性進展可能無多大關系，對評價患者的預后意義較小。

Wnt信號通路的過度激活常引起腫瘤侵襲轉移能力的增強，黏附分子CD44作為Wnt信號通路上突出的靶基因，其過度表達是影響腫瘤轉移的一個重要機制［9］。CD44是目前發現的五類細胞黏附分子之一(整合素、免疫球蛋白超基因家族、選擇素、鈣黏附素和CD44)，CD44基因的表達產物是一種細胞表面的跨膜糖蛋白，能與多種配體分子結合，參與細胞與細胞、細胞與基質之間特異性粘連。

CD44基因的外顯子按表達方式分為兩種類型:標準構型CD44s和變異型CD44v。CD44v6為CD44v亞型之一，在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、宮頸癌、腎癌和非霍奇金淋巴瘤等多種腫瘤組織中均有顯著高表達，并與惡性腫瘤進展程度、轉移及預后密切相關［10］。在胃癌中的研究發現，CD44v6在組織中呈顯著過表達，且與腫瘤的部位、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期均有關，并且是胃癌預后的重要標記物［11］。在乳腺癌中，CD44v6同樣呈高表達，并且與腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期有關［12］。本研究通過檢測不同結直腸組織中CD44v6的蛋白表達情況，發現在正常黏膜和結直腸腺瘤中其表達缺失，而在CRC組織中顯著高表達，陽性率為55．6%，提示CD44v6可能在一定程度上參與了CRC的進程。Jurrit等［13］研究發現 C57BL/6J-CD44-/-APCMin/+小鼠腸腺瘤的形成較C57BL/6J-CD44+/+APCMin/+小鼠減少50%，暗示CD44參與了腸腺瘤的啟動。本實驗 CD44v6在腺瘤組織中表達缺失，提示CD44v6對人結直腸腺瘤的發生并無直接影響，可能是CD44的其他亞型參與該過程。本研究還發現CD44v6在CRC中的表達與腫瘤的大小及腫瘤細胞的分化程度不相關，而與淋巴結轉移有關。23例有淋巴結轉移的病例，17例檢測到CD44v6陽性表達，陽性率高于無淋巴結轉移的病例，由此可見，CD44v6的表達與腫瘤的轉移相關聯。Amirghofran等［14］研究表明，有淋巴結轉移的 CRC患者血清CD44v6水平顯著增高，并與腫瘤組織中的高表達呈正相關，表明CD44v6在CRC的浸潤轉移過程中發揮著重要作用，做為CRC預后檢測的腫瘤標志物尚需更多實驗來證實。

Wnt信號通路的持續異常激活，一方面導致GSK-3β的功能失活引起異常表達，最終引起細胞的增殖，CRC的形成;另一方面，通過激活Wnt信號特定靶基因CD44等的轉錄，調控細胞的遷移，而CD44v6 直接參與腫瘤的浸潤轉移過程［15，16］。經Spearman秩相關分析，GSK-3β和CD44v6在CRC中的表達并無顯著相關性，提示二者可能作為Wnt通路上兩個獨立的調控因子分別參與CRC的發生發展。

由此可見，GSK-3β在正常黏膜、腺瘤及CRC中均有表達，并呈階梯式增高趨勢，但其表達與CRC各臨床病理參數無關，提示其參與了結直腸腫瘤的發生，而與CRC的轉移進展無關。CD44v6在正常黏膜及腺瘤中不表達，在CRC組織中呈高表達，并與淋巴結轉移密切相關，意味著CD44v6并不參與結直腸腫瘤的發生，而與CRC的轉移進展有關。當然，由于本研究例數的限制，可能對實驗結果造成誤差，目前還在收集病例及新鮮標本做進一步的研究，希望能對二者在結直腸癌中的表達進行更深入的研究，為結直腸癌的預后及靶向治療提供一定的依據。

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