超臨界CO2萃取洛伐他汀的工藝優化

周 慧，曾品濤(山西醫科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，太原 03000;揚子江藥業集團四川海蓉藥業有限公司;通訊作者，E-mail:zhouhui_984@6．com)

洛伐他汀(lovastatin)是目前臨床上重要的降血脂藥物，對原發性高膽固醇血癥十分有效，是由真菌產生的一種甲基羥二戊酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能通過抑制HMG-CoA還原酶，減少膽固醇的合成，并上調肝細胞表面低密度脂蛋白受體的表達，加速血液中低密度脂蛋白膽固醇向肝臟的轉移與代謝清除，從而達到降低血脂的功效［1］。洛伐他汀的提取一般采用溶媒萃取法［2-4］，但此法耗用大量溶媒，成本較高，經多次轉提，收率較低。作者采用超臨界CO2流體對洛伐他汀進行提取，探討超臨界CO2萃取的最佳條件及工業應用前景。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

TC-SPE-50-0．5-210S 型0．5 L 超臨界萃取儀(沈陽天誠超臨界萃取有限公司);Ultrospec 4300TM紫外分光光度計(美國GE He2althcare);Waters高效液相色譜儀(Waters1525二元泵，Waters2487紫外檢測器);Breeze液相色譜工作站。菌渣(重慶大新藥業股份有限公司);洛伐他汀(上海信然生物技術有限公司，HPLC歸一化法測定含量為99．8%);CO2食品級(99．5%，重慶朝陽氣體廠);其他試劑均為市售分析純。

1．2 提取方法及實驗設計

稱取100．0 g經干燥的紅曲霉發酵液菌渣9份，置超臨界萃取釜中，加入適量夾帶劑，按程序升溫加壓，進行動態萃取，CO2流量為4．6 L/h，解析壓力為7 MPa，定量泵入夾帶劑。萃取結束后從解析釜收集產品，減壓回收乙醇，得到洛伐他汀粗品［5］。

本研究通過單因素實驗，考察了萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑用量(C)、萃取時間(D)對洛伐他汀萃取率的影響;通過正交實驗(因素水平見表1)優化超臨界提取洛伐他汀的最佳工藝條件，并比較了各因素對萃取效果的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels

1．3 洛伐他汀產品檢測

用Waters高效液相色譜繪制洛伐他汀標品標準曲線，線性范圍為 0．248-1．24 μg，色譜條件為:Shimadzu C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相為乙腈 -0．2%H3PO4溶液(60∶40);流速為 1．0 ml/min;檢測波長238 nm;柱溫為室溫。標線方程為:Y=0．800 ×106X+2．657 6 ×105(r=0．999 7)［6-8］。

準確稱取80．3 mg洛伐他汀粗品，用甲醇溶解定容至50 ml，0．45 μm 濾膜過濾，用高效液相色譜進行檢測，計算產品純度，并將產品質量換算為純的洛伐他汀質量計算萃取率。

2 結果

2．1 單因素實驗

萃取壓力通常是影響萃取率的一個重要因素［9，10］，作者通過單因素實驗測定壓力對萃取率的影響，選用95%乙醇做夾帶劑，萃取溫度55℃，分別在 15，20，25，35，40 MPa 下進行萃取 100 min，結果見圖1，可以看出超臨界CO2萃取洛伐他汀的最佳壓力為25 MPa。

圖1 萃取壓力對洛伐他汀萃取率的影響Figure 1 Effect of extraction pressure on the extraction rate

作者同樣采用單因素試驗考察萃取溫度［9，10］對洛伐他汀萃取率的影響，選用95%乙醇做夾帶劑，萃取壓力25 MPa進行萃取100 min，，萃取溫度分別為40，45，50，55，60，65 ℃時的萃取率，結果見圖 2，可以看出最佳溫度為55℃。

圖2 萃取溫度對洛伐他汀萃取率的影響Figure 2 Effect of extraction temperature on the extraction rate

作者考察了95%乙醇做夾帶劑，萃取壓力25 MPa，萃取溫度55℃條件下，萃取時間分別為60，80，100，120，140 min 時洛伐他汀的萃取率。從圖3可以看出，100 min以后萃取率基本不增長，故選擇萃取100 min。

考慮到藥品原料“綠色環?！毙枨?，本研究選用95%乙醇作夾帶劑，用量分別為菌渣的500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 ml/kg。其他因素條件為:萃取壓力25 MPa，萃取溫度55℃，萃取100 min。實驗結果見圖4。從結果看出，夾帶劑用量低于2 000 ml/kg時，隨著夾帶劑用量的增大，萃取率升高;當夾帶劑用量超過2 000 ml/kg萃取率開始下降，所以我們選擇夾帶劑用量為2 000 ml/kg。

圖3 萃取時間對洛伐他汀萃取率的影響Figure 3 Effect of extraction time on the extraction rate

圖4 夾帶劑用量對洛伐他汀萃取率的影響Figure 4 Effect of entrainer level on the extraction rate

2．2 正交試驗

根據文獻［11，12］方法及單因素試驗結果，采用L9(34)正交表進行實驗，試驗結果見表2。分析得到超臨界CO2萃取洛伐他汀的最佳工藝條件為A2B3C2D2，由于在正交實驗中沒有包含此工藝條件，故對其進行驗證實驗(見表3)，并同正交實驗中表現最佳的“實驗6”結果進行比較。本工藝條件下洛伐他汀萃取率可高達97．17%，高于“實驗6”的萃取率95．53%。因此，超臨界CO2提取洛伐他汀的最佳工藝條件為:萃取壓力25 MPa，萃取溫度55℃，夾帶劑用量為2 000 ml/kg，萃取時間100 min。

用極差分析法對正交實驗結果進行分析，由極差值可知，影響提取物中洛伐他汀含量的因素，逐次順序為:萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間＞夾帶劑用量。

用方差分析法對正交實驗結果進行分析(見表4)，根據F分布表判斷各因素對實驗效果影響的程度:萃取壓力(A)對提取物中洛伐他汀的含量有比較顯著影響，萃取溫度(B)、夾帶劑用量(C)、萃取時間(D)影響不顯著。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of the orthogonal test

表3 驗證試驗結果 (n=3)Table 3 The results of proof test (n=3)

表4 洛伐他汀含量方差分析Table 4 Variance analysis of the lovastatin content

3 討論

從影響洛伐他汀萃取率各因素的單因素試驗結果我們可以看出，萃取壓力增加，可以提高超臨界流體的溶解能力，提高提取物產量，但過高的萃取壓力卻會影響超臨界流體的溶解選擇性，導致更多的雜質與目標提取物競爭溶出，反而降低了目標提取物的產量和純度，萃取壓力≥25 MPa時，洛伐他汀的萃取率反而下降;萃取過程中，隨著溫度的升高，洛伐他汀的溶解度增大，萃取率增加，當溫度達55℃以上時，超臨界CO2流體的密度減小、溶解性能下降，萃取率下降;萃取過程隨著時間的延長，洛伐他汀的萃取率增加，當萃取100 min以后萃取率基本保持不變，綜合考慮經濟、節能等因素，我們選擇100 min為最佳提取時間;本研究選用95%乙醇作夾帶劑，夾帶劑用量少時，萃取率較低，可能是因為夾帶劑用量少，不能將洛伐他汀充分溶解其中;夾帶劑用量大時，溶解了其他成分，雜質較多，萃取率降低，故我們選擇夾帶劑用量為2 000 ml/kg。

根據正交試驗結果以及驗證試驗的對比，我們確定超臨界CO2萃取洛伐他汀的最佳工藝條件為:萃取壓力25 MPa，萃取溫度50℃，夾帶劑用量為2 000 ml/kg，萃取時間100 min，萃取率可達97．17%。各工藝參數對提取效果的影響排序為:萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間＞夾帶劑用量。

超臨界CO2萃取洛伐他汀萃取率高達97．17%，遠高于傳統溶媒提取法，CO2可重復使用，不存在有機溶劑殘留問題，無污染，具有環境友好、生產周期短、生產環境安全、成本低的優點，適應工業化生產的需求，有廣闊的工業應用前景。

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