應(yīng)用EP7-A2文件評價免疫比濁法測定D-二聚體抗脂濁能力

聶 濱，陶天陸，黃 濤，肖華勇

(宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗科，四川宜賓644000)

D-二聚體作為纖維蛋白溶解過程中一種特異性降解產(chǎn)物[1]，具有高度敏感性和極佳的陰性預(yù)期值，已作為血栓性疾病的首選篩選實驗。免疫比濁法是測定D-二聚體的推薦方法[2]，但免疫比濁法易受脂血干擾。為了解脂血對免疫比濁法測定D-二聚體的干擾程度，我們按EP7-A2文件要求評價了D-二聚體免疫比濁法。

材料和方法

一、儀器和試劑

BE-X血凝儀;上海太陽生物技術(shù)有限公司D-二聚體測定試劑盒(批號:4042035);日立7600-020全自動生化儀;120 000濁度乳糜干擾試劑和測定甘油三酯的試劑均由邁克公司提供。檢測均在檢測系統(tǒng)質(zhì)控合格后進(jìn)行。

二、基礎(chǔ)標(biāo)本準(zhǔn)備

取實驗當(dāng)天高D-二聚體濃度新鮮血漿(無脂血、溶血和黃疸)制備1.668 mg/mL混合血清，甘油三酯濃度為0.52 mmol/L。

三、配對差異實驗

1.標(biāo)本準(zhǔn)備 (1)基礎(chǔ)標(biāo)本制備方法同前，D-二聚體濃度為1.668 mg/mL;(2)儲存液:將干擾試劑用2 mL蒸餾水復(fù)溶后作為儲存液;(3)測試標(biāo)本和對照標(biāo)本:依EP7-A2文件要求，儲存液∶基礎(chǔ)標(biāo)本=1∶19制備測試標(biāo)本，對照標(biāo)本用蒸餾水補(bǔ)足。測試標(biāo)本乳糜濁度為1 200，甘油三酯濃度為3.52 mmol/L。

2.重復(fù)測定次數(shù)的確定 計算最大允許干擾值Dmax與批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差(s)的比值，然后查 Dmax/s與重測次數(shù)對應(yīng)表[3]，可得出分析物濃度水平重復(fù)測定次數(shù)。s通常由基礎(chǔ)樣本重復(fù)測定10次計算可得;Dmax為各項目臨床意義差別的標(biāo)準(zhǔn)，本實驗的Dmax為10%(由D-二聚體試劑盒提供)。

3.檢測要求 按交互的順序檢測測試標(biāo)本(C)和對照標(biāo)本(T)。如 C1T1C2T2C3T3...CnTn。如果檢測系統(tǒng)受攜帶污染影響，增加額外的標(biāo)本使對照標(biāo)本免受來自測試標(biāo)本攜帶污染的影響，增加的額外對照標(biāo)本結(jié)果應(yīng)舍棄。如C1T1CxCxC2T2CxCxC3T3...CxCxCnTn。

4.進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 (1)計算觀察到的干擾效應(yīng)的“點估計”，即dobs，是測試標(biāo)本均值和對照標(biāo)本均值之間的差值。dobs=Interference=test－connol;(2)計算cut-off值dc(雙側(cè)檢驗)。

dnull是無效假設(shè)規(guī)定的值，通常為0，對于單側(cè)檢驗，用 Z1－取代 Z1－/2，Z1－/2查表[3]結(jié)果為1.960。

四、干擾劑量效應(yīng)實驗

1.標(biāo)本準(zhǔn)備 (1)基礎(chǔ)標(biāo)本和儲存液:同配對差異實驗;(2)高濃度標(biāo)本(H):用基礎(chǔ)標(biāo)本稀釋儲存液，制備成所需的濃度;(3)低濃度標(biāo)本(L):低濃度標(biāo)本的制備可參照基礎(chǔ)標(biāo)本的制備方法;(4)測試標(biāo)本:制備一系列不同濃度的干擾測試標(biāo)本，通常5個濃度足夠確定一個線性的劑量效應(yīng)關(guān)系，其配置要求為L、75%L+25%H、50%L+50%H、25%L+75%H、H。分別測量這5種濃度的D-二聚體和甘油三酯值。

2.重測次數(shù)的確定 通常為3次。

3.檢測要求 在同一分析批之內(nèi)檢測5個標(biāo)本的濃度，第1組按照升序測定各標(biāo)本，第2組按降序測定，第3組按照升序測定。

4.劑量效應(yīng)分析 (1)線性效應(yīng):如果數(shù)據(jù)隨機(jī)分布，成一條直線，可用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，確定其斜率、截距、標(biāo)準(zhǔn)誤(每個點而非平均值)，在圖上繪制平均線;(2)非線性效應(yīng):如各濃度水平干擾不是一個線性函數(shù)，繪圖時顯示是彎曲的，則利用非線性二次多項式公式計算給定的干擾物濃度的干擾度。

結(jié) 果

一、配對差異實驗

1.重測次數(shù)的確定 基礎(chǔ)標(biāo)本10次測定的D-二聚體濃度分別為:1.650、1.660、1.661、1.642、1.661、1.712、1.660、1.664、1.689 和1.681，均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為 1.668 和 0.020 5;Dmax為0.1，s為分析物濃度水平的 Dmax/s＞3，查表可知，重測次數(shù)為3次。

2.干擾效應(yīng)結(jié)果 利用BE-X血凝儀檢測D-二聚體濃度，對照標(biāo)本結(jié)果為 1.634、1.569 和1.627，均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.610 和0.035 7;測試標(biāo)本結(jié)果為 1.531、1.482 和 1.521，均值為1.511;1 200 濁度時，dobs=0.099 ＞ dC=(0+0.035 7×1.96)/1.732=0.040 4，表明乳糜1 200濁度對D-二聚體濃度檢測有負(fù)干擾。

二、計量效應(yīng)實驗

1.重復(fù)測定次數(shù) 按EP7-A2文件通用要求本研究每個濃度水平重復(fù)測定次數(shù)為3次。

2.計量效應(yīng)分析 按干擾物在血清中影響實驗的最高濃度水平對貯存液進(jìn)行相應(yīng)稀釋后，乳糜最高干擾物濃度(H)為4 800濁度，甘油三酯14.04 mmol/L。對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)干擾，干擾效果見表1，線性方程為 Y=1.682 －0.000 974 5 X，計量效應(yīng)回歸分析圖見圖1。

表1 不同乳糜濃度對D-二聚體測定干擾影響(mg/mL)

圖1 乳糜對D-二聚體測定劑量效應(yīng)圖

討 論

目前，D-二聚體檢測方法多種多樣，免疫比濁法已被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于肺栓塞、深靜脈血栓性疾病排除診斷方法，該方法除簡便快速、滿足急診需要外，還能定量測定，具有較高的敏感性和陰性預(yù)測值、較好的重復(fù)性和特異性[2]，但免疫比濁法易受脂血干擾。

EP7-A2[3]文件為我們提供了干擾實驗方案，當(dāng)配對差異實驗提示有干擾時，利用劑量效應(yīng)實驗進(jìn)一步確定不同濃度水平干擾度。本研究用邁克公司提供干擾試劑盒，配對差異實驗結(jié)果顯示，dobs=0.099 ＞dc=0.040 4，表明乳糜 1 200 濁度對D-二聚體免疫比濁法檢測有負(fù)干擾。劑量效應(yīng)回歸分析實驗結(jié)果表明，乳糜≤4 800濁度時，分析物濃度水平的劑量效應(yīng)回歸方程均為一次線性負(fù)干擾。線性回歸方程為 Y=1.682－0.000 974 5X，r=0.980，說明線性好，用該回歸方程可準(zhǔn)確計算出有乳糜干擾時D-二聚體的含量，為高血脂患者正確評價栓塞性疾病提供依據(jù)。

我們曾在配對差異實驗中選擇D-二聚體為0.35 mg/mL進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)加入干擾物引起濃度變化小，不能判斷是干擾物原因還是精密度原因，故本實驗選擇較高分析物濃度實驗。我們干擾物濃度范圍為0～4 800濁度，相當(dāng)于甘油三酯0.52 ～14.04 mmol/L，這個范圍是臨床常見的血脂范圍，使實驗結(jié)果對臨床有指導(dǎo)意義。

總之，用EP7-A2評價乳糜對D-二聚體免疫比濁法檢測存在線性負(fù)干擾，該干擾在嚴(yán)格做好標(biāo)本的采集，運(yùn)送，保存及抗凝劑選擇的質(zhì)量控制下，建議對高濁度標(biāo)本進(jìn)行甘油三酯濃度檢測并根據(jù)計量效應(yīng)曲線進(jìn)行校正來最大程度的消除脂血對D-二聚體濃度的影響。

[1]吳利，周才，黃瑞玉，等.正常孕婦血漿 D-二聚體的檢測與分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2014，29(10):992-994.

[2]孫學(xué)青，韓景銀，劉兆軍.D-二聚體的臨床應(yīng)用[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2013，2:204-205.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference testing in clinical chemistry[S].EP7-A2，CLSI，2005.