應用EP7-A2文件評價免疫比濁法測定D-二聚體抗脂濁能力

聶 濱，陶天陸，黃 濤，肖華勇

(宜賓市第二人民醫院檢驗科，四川宜賓644000)

D-二聚體作為纖維蛋白溶解過程中一種特異性降解產物[1]，具有高度敏感性和極佳的陰性預期值，已作為血栓性疾病的首選篩選實驗。免疫比濁法是測定D-二聚體的推薦方法[2]，但免疫比濁法易受脂血干擾。為了解脂血對免疫比濁法測定D-二聚體的干擾程度，我們按EP7-A2文件要求評價了D-二聚體免疫比濁法。

材料和方法

一、儀器和試劑

BE-X血凝儀;上海太陽生物技術有限公司D-二聚體測定試劑盒(批號:4042035);日立7600-020全自動生化儀;120 000濁度乳糜干擾試劑和測定甘油三酯的試劑均由邁克公司提供。檢測均在檢測系統質控合格后進行。

二、基礎標本準備

取實驗當天高D-二聚體濃度新鮮血漿(無脂血、溶血和黃疸)制備1.668 mg/mL混合血清，甘油三酯濃度為0.52 mmol/L。

三、配對差異實驗

1.標本準備 (1)基礎標本制備方法同前，D-二聚體濃度為1.668 mg/mL;(2)儲存液:將干擾試劑用2 mL蒸餾水復溶后作為儲存液;(3)測試標本和對照標本:依EP7-A2文件要求，儲存液∶基礎標本=1∶19制備測試標本，對照標本用蒸餾水補足。測試標本乳糜濁度為1 200，甘油三酯濃度為3.52 mmol/L。

2.重復測定次數的確定 計算最大允許干擾值Dmax與批內標準差(s)的比值，然后查 Dmax/s與重測次數對應表[3]，可得出分析物濃度水平重復測定次數。s通常由基礎樣本重復測定10次計算可得;Dmax為各項目臨床意義差別的標準，本實驗的Dmax為10%(由D-二聚體試劑盒提供)。

3.檢測要求 按交互的順序檢測測試標本(C)和對照標本(T)。如 C1T1C2T2C3T3...CnTn。如果檢測系統受攜帶污染影響，增加額外的標本使對照標本免受來自測試標本攜帶污染的影響，增加的額外對照標本結果應舍棄。如C1T1CxCxC2T2CxCxC3T3...CxCxCnTn。

4.進行數據分析 (1)計算觀察到的干擾效應的“點估計”，即dobs，是測試標本均值和對照標本均值之間的差值。dobs=Interference=test－connol;(2)計算cut-off值dc(雙側檢驗)。

dnull是無效假設規定的值，通常為0，對于單側檢驗，用 Z1－取代 Z1－/2，Z1－/2查表[3]結果為1.960。

四、干擾劑量效應實驗

1.標本準備 (1)基礎標本和儲存液:同配對差異實驗;(2)高濃度標本(H):用基礎標本稀釋儲存液，制備成所需的濃度;(3)低濃度標本(L):低濃度標本的制備可參照基礎標本的制備方法;(4)測試標本:制備一系列不同濃度的干擾測試標本，通常5個濃度足夠確定一個線性的劑量效應關系，其配置要求為L、75%L+25%H、50%L+50%H、25%L+75%H、H。分別測量這5種濃度的D-二聚體和甘油三酯值。

2.重測次數的確定 通常為3次。

3.檢測要求 在同一分析批之內檢測5個標本的濃度，第1組按照升序測定各標本，第2組按降序測定，第3組按照升序測定。

4.劑量效應分析 (1)線性效應:如果數據隨機分布，成一條直線，可用最小二乘法進行回歸分析，確定其斜率、截距、標準誤(每個點而非平均值)，在圖上繪制平均線;(2)非線性效應:如各濃度水平干擾不是一個線性函數，繪圖時顯示是彎曲的，則利用非線性二次多項式公式計算給定的干擾物濃度的干擾度。

結 果

一、配對差異實驗

1.重測次數的確定 基礎標本10次測定的D-二聚體濃度分別為:1.650、1.660、1.661、1.642、1.661、1.712、1.660、1.664、1.689 和1.681，均值和標準差分別為 1.668 和 0.020 5;Dmax為0.1，s為分析物濃度水平的 Dmax/s＞3，查表可知，重測次數為3次。

2.干擾效應結果 利用BE-X血凝儀檢測D-二聚體濃度，對照標本結果為 1.634、1.569 和1.627，均值和標準差分別為1.610 和0.035 7;測試標本結果為 1.531、1.482 和 1.521，均值為1.511;1 200 濁度時，dobs=0.099 ＞ dC=(0+0.035 7×1.96)/1.732=0.040 4，表明乳糜1 200濁度對D-二聚體濃度檢測有負干擾。

二、計量效應實驗

1.重復測定次數 按EP7-A2文件通用要求本研究每個濃度水平重復測定次數為3次。

2.計量效應分析 按干擾物在血清中影響實驗的最高濃度水平對貯存液進行相應稀釋后，乳糜最高干擾物濃度(H)為4 800濁度，甘油三酯14.04 mmol/L。對結果產生負干擾，干擾效果見表1，線性方程為 Y=1.682 －0.000 974 5 X，計量效應回歸分析圖見圖1。

表1 不同乳糜濃度對D-二聚體測定干擾影響(mg/mL)

圖1 乳糜對D-二聚體測定劑量效應圖

討 論

目前，D-二聚體檢測方法多種多樣，免疫比濁法已被美國食品藥品管理局批準用于肺栓塞、深靜脈血栓性疾病排除診斷方法，該方法除簡便快速、滿足急診需要外，還能定量測定，具有較高的敏感性和陰性預測值、較好的重復性和特異性[2]，但免疫比濁法易受脂血干擾。

EP7-A2[3]文件為我們提供了干擾實驗方案，當配對差異實驗提示有干擾時，利用劑量效應實驗進一步確定不同濃度水平干擾度。本研究用邁克公司提供干擾試劑盒，配對差異實驗結果顯示，dobs=0.099 ＞dc=0.040 4，表明乳糜 1 200 濁度對D-二聚體免疫比濁法檢測有負干擾。劑量效應回歸分析實驗結果表明，乳糜≤4 800濁度時，分析物濃度水平的劑量效應回歸方程均為一次線性負干擾。線性回歸方程為 Y=1.682－0.000 974 5X，r=0.980，說明線性好，用該回歸方程可準確計算出有乳糜干擾時D-二聚體的含量，為高血脂患者正確評價栓塞性疾病提供依據。

我們曾在配對差異實驗中選擇D-二聚體為0.35 mg/mL進行研究，發現加入干擾物引起濃度變化小，不能判斷是干擾物原因還是精密度原因，故本實驗選擇較高分析物濃度實驗。我們干擾物濃度范圍為0～4 800濁度，相當于甘油三酯0.52 ～14.04 mmol/L，這個范圍是臨床常見的血脂范圍，使實驗結果對臨床有指導意義。

總之，用EP7-A2評價乳糜對D-二聚體免疫比濁法檢測存在線性負干擾，該干擾在嚴格做好標本的采集，運送，保存及抗凝劑選擇的質量控制下，建議對高濁度標本進行甘油三酯濃度檢測并根據計量效應曲線進行校正來最大程度的消除脂血對D-二聚體濃度的影響。

[1]吳利，周才，黃瑞玉，等.正常孕婦血漿 D-二聚體的檢測與分析[J].檢驗醫學，2014，29(10):992-994.

[2]孫學青，韓景銀，劉兆軍.D-二聚體的臨床應用[J].檢驗醫學與臨床，2013，2:204-205.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference testing in clinical chemistry[S].EP7-A2，CLSI，2005.