子癇前期孕婦孕早期血清miR-520g表達分析

厲 倩，龍安雄，洪 茂，蔡雷鳴，謝 驪，顧繼安，譚龍益

(上海市第一人民醫院寶山分院檢驗科，上海200940)

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種常見的孕婦多系統紊亂綜合征，是孕婦和胎兒發病率和病死率最高的疾病之一[1]。胎兒分娩和胎盤剝離是目前PE唯一的治愈手段，如早期對高危孕婦進行干預，對減少子癇的發生及減輕其危害具有一定的價值。到目前為止，PE的病因和病理學機制尚不清楚，且缺乏理想的預測和早期診斷指標。2007年LIANG等[2]發現了胎盤特異性微小RNA(microRNA，miR)，隨后胎盤特異性miR被證實在孕期血漿/血清中穩定存在，循環胎盤特異性miR可能是妊娠相關疾病的良好生物標志物。本研究利用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測 PE患者和正常對照不同孕期血清中胎盤特異性miR-520g的表達量，探討血清miR-520g對孕婦PE是否具有一定的預測價值。

材料和方法

一、研究對象

本研究納入了2011年1月至2013年12月在上海市第一人民醫院寶山分院分娩的30例PE患者和30名無明確妊娠相關疾病產婦。PE的診斷標準依據第7版婦產科學[3]，即妊娠20周后收縮壓≥18.7 kPa和/或舒張壓≥12.0 kPa伴蛋白尿≥0.3 g/24 h，或隨機蛋白尿陽性。所有研究對象都是單胎妊娠，對照組和病例組的年齡、孕前體重指數(body mass index，BMI)沒有顯著差異，具體臨床特征見表1。30名正常妊娠者全部完成了孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血液樣本的收集，30例PE患者收集孕早期血液樣本14例、孕中期血液樣本30例、孕晚期血液樣本30例。

表1 研究對象臨床特征

二、樣本采集、處理及保存

用分離膠真空采血管采集空腹血液樣本3～5 mL，靜置20 min后以1 200×g離心10 min。首次離心后收集上清并高速(12 000×g)離心10 min，轉移上清于無RNA酶的無菌Eppendorf管中，－80℃凍存備用。

三、RNA抽提

利用miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)提取血漿/血清總 RNA，說明書具體步驟如下:在200μL血漿/血清中加入1 mL的Qiazol溶解液，充分混勻后室溫放置 5 min加入 3.5μL Cel miR-39(1.6×108/μL，Qiagen)作為內參，加入200μL氯仿，充分混勻后室溫放置3 min，置低溫離心機(Sigma)內 12 000×g離心 15 min，將550μL上層澄清萃取液轉移到新的1.5 mL無菌Eppendorf管中，加入1.5 倍(825μL)的無水乙醇，充分混勻，分2次將混合液過洗脫柱，棄去濾過液，洗脫柱分別用700μL RWT、RPE緩沖液和80%乙醇溶液洗滌，末次洗滌后洗脫柱高速(12 000×g)離心5 min以干燥柱內膜，最后加入14μL無RNA酶水洗脫總RNA。

四、cDNA第一鏈合成

利用miScriptⅡ逆轉錄試劑盒(Qiagen)合成cDNA第一鏈(加尾法)，具體如下:150μL PCR反應管中加入2μL10×RT mix，2μL10×nucleics mix，8μL無RNA酶水，4μL 5×hispec Buffer和4μL總RNA，充分混勻并低速(1 200×g)離心1 min后置于擴增儀(Bioer)中，36℃1h，95℃5min。

五、熒光定量PCR

利用miScirpt SYBR green PCR試劑盒(Qiagen)和ABI7500擴增儀進行熒光實時定量。反應體系如下:10μL 2×master mix，2μL 10×通用引物，2μL 10×特異性引物，4μL 無 RNA 酶水和2μL 100倍稀釋的cDNA模板。擴增條件如下:95 ℃變性15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃34 s，延伸階段采集熒光信號，共40個循環。內參基因選擇RNA抽提過程中加入的Cel miR-39。Cel miR-39和miR-520g在2孔中進行擴增。每個標本都做3個平行復孔，取Ct平均值。所有熒光定量PCR在96孔反應板內進行，單個標本miR-520g的表達量用相對miR-39的Ct差值表示。差異表達的相對定量分析用2－ΔΔCt法。

六、統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析。組間miR-520g的比較用Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。miR-520g在各組的表達量用箱圖來表示。

結 果

一、正常妊娠組孕早、中、晚期血清miR-520g表達量的變化

在正常妊娠組，血清miR-520g的表達量隨著孕程進展有逐步升高的趨勢，見圖1，孕中期(孕20～24周)、孕晚期(孕28～32周)的 miR-520g表達量顯著高于孕早期(孕12～14周)，孕晚期miR-520g表達量高于孕中期，但差異無統計學意義(P ＞0.05)。

圖1 正常妊娠組不同孕周血清miR-520g表達量

二、PE患者早、中、晚期血清miR-520g表達量

PE患者孕早期miR-520g表達量顯著高于正常妊娠照組，而孕中期和孕晚期miR-520g的表達量在兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖 2。

圖2 PE患者與正常妊娠者不同孕周血清miR-520g相對表達量的比較

討 論

miR是一類全長為19～25個核糖核苷酸的非編碼調控單鏈小分子RNA，由一段具有發卡環結構的單鏈RNA前體剪切后生成，通過與目標mRNA分子的3'-端非編碼區域(3'-UTR)互補配對使目標mRNA分子的翻譯受到抑制，從而在轉錄后對靶基因的表達水平進行調控。生物信息分析顯示只占了人類基因組1%～3%的miR調控著高達30%的人類基因。在不同組織及不同發育階段，不同miR的表達水平有顯著差異。近年的研究表明miR在細胞增殖、分化、凋亡，腫瘤形成，心血管疾病等生理和病理過程中都有非常重要的作用[4]。自 2008年MITCHELL等[5]在人血清/血漿中穩定檢測到腫瘤來源的miR以來，循環miR作為生物標記物受到越來越多的關注。

PE是一種常見的妊娠相關疾病，是孕婦和胎兒發病率和病死率最高的疾病之一[1]。主要表現為在懷孕20周后出現高血壓和蛋白尿，部分患者出現水腫、頭痛，嚴重者發生子癇、肝腎功能和凝血障礙、成人呼吸窘迫綜合征和胎兒發育障礙等，發生過子癇的孕婦其后患高血壓、心血管疾病的風險也大大增加。胎兒分娩和胎盤剝離是目前唯一的治愈手段，但早期對高危孕婦進行干預，對減少子癇的發生及減輕其危害具有一定價值。血清可溶性血管內皮生長因子受體1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1，sFlt-1)、胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)水平等可能在PE的預測中有一定價值[6]，但目前尚無有效、可靠和經濟的預測方法。近年來多項研究指出PE胎盤中存在異常表達的miR，如 miR-210、miR-1、miR-181a、miR-584 等，這些異常表達的miR可能通過調節相應的靶基因，調節滋養細胞的遷移和血管的重塑，從而在PE的病理過程中發揮重要作用[7-9]。這些在胎盤中異常表達的miR部分被證實在血清/血漿中也有異常表達[10]，但胎盤和循環 miR的結果并不總是一致，有時甚至相反，不同的妊娠時期血清中的miR也處于動態變化中，本研究結果也顯示miR-520g表達量在正常妊娠過程中隨孕周逐步升高。

在PE胎盤異常表達的miR中有一類胎盤特異性miR，他們在胎盤以外的其它組織中表達很少甚至沒有，而在胎盤中表達豐度較高。胎盤特異性 miR多來自 19號染色體，如 miR-517a、519d、520g、520h 等[2]。由于不受其它組織疾病的影響，胎盤特異性miR表達譜可能在妊娠相關疾病的預測、診斷中有重要價值。本研究檢測了30例單胎妊娠的健康孕婦不同孕期血清中miR-520g的表達量，發現循環miR-520g在正常妊娠組的表達量隨孕周逐步上升，這可能與胎盤組織的逐漸增大相關，與HROMADNIKOVA等[11]報道的關于miR-516、miR-517等胎盤特異性miR的結果一致。我們進一步檢測了30例單胎妊娠的PE患者不同孕期血清miR-520g的表達量，發現PE患者孕早期的miR-520g表達量異常上調，而孕中、晚期的miR-520g表達量與正常妊娠組無明顯差異，這可能與孕早期胎盤螺旋動脈重塑過程有關。胎盤淺著床和子宮螺旋動脈重塑不良被認為是PE發生的重要病理機制，螺旋動脈重塑主要發生在孕12～20周。生物信息分析發現胎盤特異性 miR-520g的靶基因中有 ephrin b2(EFNB2)及其受體ephrin receptor b4(EPHB4)，而EFNB2/EPHB4被認為在血管形成、胎盤發育及螺旋動脈重塑過程中都具有重要作用[12]，但miR-520g與EFNB2/EPHB4的關系有待進一步實驗來證實。

本研究首次報道了正常妊娠及PE患者不同孕期血清胎盤特異性miR-520g的表達量，發現孕早期miR-520g可能對PE的早期預測有一定的價值。miR-520g如何參與PE的發生和發展、血清miR-520g表達量與PE嚴重程度的相關性等值得更深入的研究來進一步論證，這將有助于PE病理機制的闡明和防治。

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