流式細胞術檢測外周血白血病細胞在AL復發的臨床價值研究

方健源，謝碧霞，羅 韜，胡淑芬，譚冬梅

(1.廣州市番禺區中心醫院檢驗科，廣東廣州511400;2.廣州市番禺區中心醫院血液科，廣東廣州511400)

隨著白血病治療方案的改進，白血病治療水平不斷提高，急性白血病(acute leukemia，AL)有了較高的緩解率，但仍有相當一部分患者復發。目前認為造成白血病復發的關鍵因素是白血病經治療后體內仍殘留少量的腫瘤細胞，即存在微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)，這些腫瘤細胞的克隆增殖導致白血病復發。白血病細胞通常表達異常的表面抗原表型，即白血病相關表型[1]，具有異常光散射特性，因此能與正常造血成分相互區別。聯合利用多種單克隆抗體，多參數流式細胞術(flow cytometry，FCM)可以同時檢測細胞表面不同抗原表達的多參數熒光信號，進而識別完全緩解后混于正常造血細胞中的MRD。本研究收集AL患者的骨髓和外周血標本進行檢測分析，探討FCM檢測外周血白血病細胞在AL復發的臨床價值。

材料和方法

一、研究對象

選擇2012年1月至2013年12月廣州市番禺區中心醫院血液科收治的71例AL患者(不包括急性早幼粒細胞白血病患者)，其中急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)44例、急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)27例，于達完全緩解時及鞏固化療期間監測。診斷符合FAB及2008年世界衛生組織的診斷標準[2]。

二、方法

1.多參數FCM 采集外周血乙二胺四乙酸二鉀抗凝，利用四色熒光(4種熒光素分別為異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、別藻青蛋白、多甲藻葉綠素蛋白)直接免疫標記法進行免疫分型檢測。在每支檢測試管中加1×106有核細胞。根據每例患者的白血病特點選擇單克隆抗體組合(試劑均為美國BD公司產品)，按照試劑說明書進行操作。至少收集10萬個可供分析的有核細胞，用流式細胞儀(美國BD公司)收集細胞，每支試管用配套的CellQuest軟件分析細胞標志。根據原始細胞上抗原是否跨系表達、表達不同步(不同階段的抗原同時表達)、表達過強、表達過弱、丟失等判定是否為MRD，MRD≥0.01% 為陽性，否則為陰性。

2.骨髓細胞形態學檢測 骨髓液涂片6～8張，經吉姆薩-瑞士染色后，在日本OLYMPAS顯微鏡油鏡下分類200個細胞，根據形態進行不同階段的分類計數。根據張之南等[3]主編的《血液病診斷及療效標準》(第3版)判斷療效是否為復發。

三、治療方案

AML(非M3)的誘導化療方案采用柔紅霉素加阿糖胞苷、去甲氧柔紅霉素加阿糖胞苷或米托蒽醌加阿糖胞苷方案。骨髓達完全緩解后采用原方案鞏固強化治療2個療程，然后分別用中或大劑量阿糖胞苷治療，完成4個療程休息2個月，用柔紅霉素加阿糖胞苷和米托蒽醌加阿糖胞苷方案交替治療2個療程，每療程間隔3個月，此后停止化療，定期隨訪。ALL治療:誘導緩解為VDCP方案(長春新堿 2 mg，第 1、8、15、22 天;柔紅霉素45 mg/m2，第1天至第3天，第15天至第16天;環磷酰胺1 000 mg/m2，第1、15天;潑尼松每天1 mg/kg，14 d)，完全緩解后進入鞏固強化治療。

71例AL患者在誘導化療結束獲得完全緩解后開始隨訪，至復發隨訪結束，未復發隨訪至今，隨訪時間1～24個月，中位數16個月。

四、統計學方法

應用SPSS 13.0軟件對數據進行分析，計數資料以百分率(%)表示，組間比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、FCM檢測AL患者外周血MRD

以FAB分型骨髓形態學作為判斷復發的金標準;部分患者定期接受多次檢查，外周血MRD結果以首次結果為準。FCM檢測外周血MRD對提示AML和ALL復發的敏感性和特異性見表1。

表1 FCM檢測外周血MRD對提示AL復發的敏感性和特異性 [例(%)]

二、外周血 MRD陰性組與陽性組復發率比較

12例外周血MRD陰性組中有3例(25.0%)患者復發，59例外周血MRD陽性組中有44例(74.6%)復發，MRD陽性組復發率明顯高于MRD陰性組(P＜0.05)。外周血MRD陰性組與陽性組在24個月隨訪期間的復發率比較見圖1。

三、高低外周血MRD水平復發率比較

59例AL患者外周血MRD定量值按高MRD水平(≥10－2)和低 MRD水平(＜10－2)分成 2組，高MRD水平組38例，低MRD水平組21例。2組復發例數分別是37例(97.4%)和10例(47.6%)。高MRD水平組復發率明顯高于低MRD水平組(P ＜0.05)。

圖1 外周血MRD陰性組與陽性組復發率比較

討 論

多參數FCM的免疫分型對MRD的檢測已成為研究AL的基本手段，并為AL的診斷、治療及預后判斷提供重要依據。趙利東等[4]研究提出誘導治療能殺死大量的白血病細胞，但尚未徹底清除，少數患者初次誘導緩解時MRD值持續陽性直至復發。是否達到完全緩解以及緩解的程度是影響患者預后的重要參數之一。臨床上對AL治療效果的評價主要通過骨髓細胞形態學檢查，其具有一定的局限性，骨髓穿刺取材只能反映一部分的骨髓情況。采用骨髓細胞形態學診斷標準一般在體內白血病細胞數超過1%時方能檢測到，而體內MRD的持續存在會導致患者最終白血病的復發。從患者角度出發，反復骨髓穿刺難以接受，而外周血取材方便，采集外周血無疑更合適。為此，我們針對AL患者的骨髓和外周血標本進行檢測分析，探討FCM檢測外周血白血病細胞在AL復發的臨床價值。

我們用FCM檢測了71例AL患者的外周血MRD，發現外周血MRD與患者的預后有明顯的相關性。FCM檢測AL患者的外周血MRD對提示AL復發具有較高的敏感性，AML組與ALL組的敏感性分別為96.6%和88.9%。MAURILLO等[5]將外周血作為 MRD的檢測對象，結果顯示外周血MRD同樣與AML患者的長期預后相關，提示外周血循環原始細胞的存在可能與骨髓中的白血病細胞的持續存在有關。本研究中有15例外周血MRD陽性但骨髓形態學檢查未達到復發的程度，這就提示此部分患者需要進一步追蹤觀察，以便采取下一步治療方案。MRD是一個強烈提示緩解和復發的預后因素。臨床應用MRD檢測可有效指導完全緩解后的治療，根據MRD的水平進行預后分級及選擇相應的化療方案等。若MRD持續陰性，可停止治療;若MRD持續陽性，應給予患者更強的化療，或考慮骨髓移植。朱勇梅等[6]對骨髓和外周血中MRD水平比較發現，兩者會因檢測時間、疾病亞型和治療方案的不同而有所不同，但存在一定的比例關系。BUCCISANO等[7]認為外周血的檢測同骨髓一樣有意義，如果同時檢測外周血及骨髓，可能提高檢出率。如果鞏固化療后外周血的MRD水平高于0.015%，復發概率增加。外周血白血病細胞水平可間接反映骨髓情況，用于治療監測。COUSTAN-SMITH 等[8]研究結果顯示，在 T-ALL骨髓與外周血MRD有很好的一致性，外周血可以用于檢測MRD;而在B-ALL，骨髓MRD檢出率高于外周血，但用外周血檢測MRD可以提供強大的預后信息。

本研究中12例外周血MRD陰性組復發率為25.0%，59例外周血 MRD陽性組復發率為74.6%，MRD陽性組復發率明顯高于MRD陰性組，結果與文獻[9]相近。國外研究提出，在鞏固治療后用FCM檢測患者的MRD，結果發現每一個危險層的MRD陽性患者與陰性患者在無病生存率和總生存率上都有顯著差異。MRD陽性患者總的復發率為74%，而MRD陰性患者的復發率僅為 27%[10]。PAWINSKA等[11]認為誘導緩解末 MRD≥10－4的患者需要在治療過程中嚴密監測MRD的變化，以便及時采取有效的治療措施。

本研究表明，高MRD水平組復發率明顯高于低 MRD水平組。張芳等[12]研究結果表明，FCM檢測的MRD水平與復發明顯相關。童春容等[13]提出，大多數AL為中等危險性患者，而且即使是一些低危險性AL患者化療后也會復發，尤其是成年白血病患者，化療后的復發率仍較高。因此需要更多的預后及檢測療效的指標，幫助指導更加個體化的治療。

綜上所述，FCM檢測外周血白血病細胞能很好地提示復發，且外周血取材方便，創傷性相對較輕，對診斷AL復發及指導個體化治療有重要意義。

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