登革熱病毒快速檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體的臨床應用評價

石亞玲，趙 蓉，黃穎怡

(廣州市第八人民醫院檢驗科，廣東廣州510060)

登革熱病毒(Dengue virus，DENV)屬黃病毒 科，是影響全球公共衛生的蚊傳播病原體。病毒基因編碼3個結構蛋白(E、C、M)和7個非結構蛋白 (NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5)，根據包膜蛋白E抗原性可分為4種血清型(DENV-1～4)。該病毒通過感染性伊蚊叮咬向人類傳播。全球有100多個國家和地區曾發生過登革熱，亞洲東南部是登革熱高發區，例如我國廣東等東南部省市[1]。2014年廣東省登革熱的暴發性流行已造成3萬多人感染，6人死亡，使登革熱的防治重新受到人們重視。登革熱的典型特征是高熱、白細胞減少和血小板降低等，嚴重者會造成患者多組織或器官出血，甚至出現登革出血熱或登革休克綜合征。所以對疑似DENV感染患者快速準確的診斷不僅能夠迅速隔離感染源，而且可以對患者及時治療，使登革熱的危害降到最低。目前國際上診斷登革熱的實驗室方法主要是病毒檢測、病毒基因檢測、病毒抗原檢測和血清學檢測4種方法，但往往耗時，有的需要昂貴的儀器設備和繁瑣的操作技術[2]。國內也已經有快速簡便的膠體金免疫層析法 (gold immunochromatographic assay，GICA)檢測試劑盒，但尚未獲得批文。我們用GICA檢測發熱患者DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體，將檢測結果與聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)-熒光探針法的結果進行比較。

材料和方法

一、材料

1.研究對象 2014年8至11月廣州市第八人民醫院就診的發熱患者血清樣本2 633例，患者年齡7個月～83歲，其中男1 327例，女1 306例。健康體檢人群樣本50例，流行性出血熱抗體陽性樣本5例，風疹/麻疹抗體陽性樣本4例。

2.試劑 DENV核酸檢測試劑由中山大學達安基因股份有限公司生產;DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體檢測試劑由廣州萬孚生物技術股份有限公司生產。

二、方法

采集患者血清，對樣本即時進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。2 633例患者樣本均采用PCR-熒光探針法檢測DENV核酸。將2 633例患者樣本分為3組并采用GICA對DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體進行檢測:Ⅰ組為948例樣本，僅檢測NS1抗原;Ⅱ組為1 156例樣本，僅檢測IgG/IgM抗體;Ⅲ組為529例樣本，同時檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體。另50名健康體檢人群樣本、5例流行性出血熱抗體陽性樣本、4例風疹/麻疹抗體陽性樣本為Ⅳ組，采用GICA檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體。

三、統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，組間比較采用配對χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Ⅰ組檢測結果

DENV NS1抗原檢測與PCR的陽性符合率為 89.09%(645/724)，陰性符合率為 92.41%(207/224)，總體符合率為 89.87%(852/948)。NS1抗原檢測結果與PCR檢測結果間差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 948例樣本檢測病毒核酸和NS1抗原的結果

二、Ⅱ組檢測結果

DENV IgG/IgM抗體檢測與PCR的陽性符合率為64.68%(663/1 025)，陰性符合率為66.41%(87/131)，總體符合率為 64.88%(750/1 156)。IgG/IgM抗體檢測結果與PCR檢測結果間差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 1 156例樣本檢測病毒核酸和IgG/IgM抗體的結果

三、Ⅲ組檢測結果

DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體檢測與PCR的陽性符合率為93.56%(392/419)，陰性符合率為61.82%(68/110)，總體符合率為86.96%(460/529)。NS1抗原及IgG/IgM抗體檢測結果與PCR檢測結果間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 529例樣本檢測病毒核酸和NS1抗原和/或IgG/IgM抗體的結果

對419例PCR-熒光探針法檢測DENV核酸陽性的樣本，采用GICA聯合檢測NS1抗原及IgG/IgM抗體，抗原和抗體相互間的結果為:NS1抗原陽性樣本357例，IgG/IgM抗體陽性樣本265例，NS1抗原陽性和/或IgG/IgM抗體陽性樣本392例。見表4。NS1抗原陽性率為85.20%(357/419)，IgG/IgM 抗體陽性率為 63.25%(265/419)，NS1抗原和/或IgG/IgM抗體陽性符合率為93.57%(392/419)。

表4 419例DENV核酸陽性樣本檢測NS1抗原和/或IgG/IgM抗體的結果

四、Ⅳ組檢測結果

采用GICA聯合檢測NS1抗原及IgG/IgM抗體，檢測結果均為陰性，特異性為100%。

討 論

DENV感染是一種系統性和功能性疾病。病毒感染后潛伏期為1～14 d，一般為5～9 d。潛伏期后病情變化迅猛，隨后進入3個時期:急性發熱期、極期和恢復期[3]，可引起一系列的臨床癥狀。雖然目前沒有針對DENV特效的抗病毒藥物，但是感染者往往在及時的診斷和合理的對癥治療后能夠康復。所以，無論是從感染者及時得到合理治療，還是從第一時間隔離傳染源出發，首先就要求臨床實驗室能夠提供快速、準確的檢測結果，以供臨床診斷參考。

目前針對DENV檢測的實驗室4種診斷方法各具優勢及局限性。病毒檢測主要是通過將患者樣本接種于蚊蟲細胞(如c6/36和AP61細胞系)或乳鼠內共培養后使樣本內病毒進入蚊蟲細胞或小鼠體內從而達到病毒分離的目的。這種方法特異性高，能夠對感染進行確定性診斷，并且還能夠確定病毒血清型，但這種方法耗時長、價格高，對樣本和實驗設備也有特定要求，在普通臨床實驗室中較難實現[4]。病毒基因檢測則是通過PCR對樣本內的病毒基因進行擴增后檢測，這種方法具有很高的敏感性和特異性，能夠在24～48 h內完成檢測，但這種方法很可能受到樣本中其它基因的干擾而出現假陽性現象[5]，需要專業知識和貴重實驗室設備，價格昂貴，上述2種方法都無法區分初次和二次感染。抗原檢測主要是用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)針對病毒中NS1抗原檢測，這是相對與病毒分離和基因檢測方法較為方便、快速的方法，但其敏感性和特異性均不理想，許多研究已經報道ELISA法檢測NS1的效應[6]。血清學檢測是對感染者體內的IgM、IgG抗體進行檢測，可區分初次和二次感染。IgM抗體是初次感染者體內出現的主要抗體，在感染者發熱的第3～5天可出現，至第10～20天99%的患者都可以檢測到IgM抗體[7];IgG則是二次感染者體內出現的主要抗體，所以IgG檢測可以用來判斷患者是初次感染還是再次感染。目前對IgM、IgG的檢測仍以ELISA為主，國外已有檢測IgM的包括微粒凝集法和橫向層析試紙條在內的快速檢測方法，并且可以針對不同血清型進行檢測，但國內均未獲得藥監局批文。目前國外檢測IgM的快速膠體金的敏感性為21% ～99%，特異性為77% ～98%，與之相比，本研究所選用的DENV IgM、IgG檢測板敏感性居中而特異性偏低。但國外IgM試劑的敏感性和特異性是以ELISA為標準計算而來，我們是以基因檢測法為標準計算而來，所以若要比較國內外DENV檢測試劑的效能仍需進一步研究。

本研究結果顯示，GICA檢測NS1抗原試劑對DENV的檢測效能比核酸技術差，但優于IgM、IgG抗體的檢測。究其原因，與核酸技術相比GICA使用的是免疫學的抗原抗體反應，免疫技術本身的局限性決定了其檢測的敏感性和特異性不如核酸檢測技術;與IgM、IgG抗體檢測試劑相比，兩者同樣使用的是抗原抗體反應原理，但NS1在感染者體內是相對單一的抗原[6]，且與NS1抗原反應的抗體是單克隆抗體，而感染者體內的IgM、IgG抗體多樣性決定了其交叉反應性的存在，致使GICA檢測IgM、IgG抗體的效能降低。

雖然NS1抗原試劑的效能優于IgM、IgG抗體試劑，但是DENV的IgM、IgG抗體檢測能夠一定程度上說明感染者是首次感染或二次感染，所以抗原檢測也不能夠完全替代抗體檢測。最佳方案則是將抗原和抗體檢測結合應用，不僅能夠快速確診患者是否為DENV感染者，還能對其病程有一定提示。故我們將NS1抗原檢測和IgM、IgG抗體檢測聯合應用后與核酸診斷進行比較，發現NS1抗原和IgG/IgM抗體聯合檢測的陽性符合率為93.56%，差異無統計學意義(P＞0.05)。

本研究使用該試劑對流行性出血熱抗體陽性樣本、風疹/麻疹抗體陽性樣本及健康人群樣本進行檢測，特異性為100%，說明該試劑對檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體結果無影響。

準確、快速的床邊診斷一直是臨床實驗室技術發展的方向。本研究結果顯示，GICA檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體具有較高的敏感性和特異性，聯合應用能夠為臨床提供快速、準確的檢測結果。但這2種試劑都不能夠對DENV血清型進行分型，這將不利于臨床對登革熱感染者病情預后的判斷，尤其是對DENV血清型為Ⅱ型的患者。我們只是初步分析這2種試劑的診斷效能，若要對其進行全面評估則還需要通過更多的樣本檢測統計和效能評價指標，希望自主研發試劑能夠更快、更好的發展，以推動我國乃至全球實驗室診斷技術的發展。

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