間接法建立生物參考區間

沈雋霏，宋斌斌 綜述，潘柏申 審校

(上海復旦大學醫學院附屬中山醫院檢驗科，上海200032)

生物參考區間通常指參考值分布的95%中心區間[1]，是解釋檢驗結果、分析檢驗信息的一個基本尺度和依據。醫學實驗室為臨床提供可靠的生物參考區間才能正確指導臨床對患者或健康體檢者的診斷和治療[2]。美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和國際臨床化學聯合會(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC)在2010年共同修訂的推薦指南《臨床實驗室如何確定和建立生物參考區間;批準指南——第3版》(EP28-A3c指南)中指出，通過建立排除標準，選取合適參考個體以獲得參考值的方法(直接法)是建立生物參考區間的標準方法[3]。然而，參考個體的選擇是直接法面臨的最困惑的問題。篩選標準的制定、疾病亞臨床狀態的存在都將直接影響到生物參考區間的取值。由于直接法操作過程復雜，耗時長，且費用昂貴，大部分實驗室均直接引用試劑廠商推薦的生物參考區間[4]。但由于人群、地域、生活習慣、疾病的流行病學表現等多方面的差異，直接引用的生物參考區間可能不適合本地區的人群。隨著計算機信息技術的發展，有學者提出利用實驗室儲存的大量數據，建立以數學統計為基礎的生物參考區間(間接法)。近年來，許多學者也紛紛采用類似的途徑報道了眾多的研究成果[5-10]。我們就近年來報道的文獻中出現的多種間接法進行簡單闡述，并比較各個方法的特點，希望對國內醫學實驗室建立生物參考區間有所幫助。

間接法建立生物參考區間是指利用醫院數據庫中已有的數據建立生物參考區間的方法[4]。間接法的優勢主要有兩點:(1)有充足、可靠的數據來源;(2)間接法的操作較直接法而言比較簡便，耗時短，成本低，有利于參考區間的建立和定期評審[3]。然而由于醫院數據有存在錯誤值的可能性，因此必須運用合適的統計學方法對醫院數據庫中可能存在的錯誤值加以剔除。根據近年的文獻報道，間接法建立生物參考區間大致可以歸納為以下4個步驟:(1)在醫院數據庫中完成足夠數量符合要求的數據采集;(2)利用合適的方法對偏態分布的數據進行數據變換;(3)剔除醫院數據中的離群值或錯誤值;(4)選取合適的方法建立生物參考區間。

一、數據采集

作為一種后驗的方法，間接法建立參考區間需要采集醫院數據庫中已有的數據。EP28-A3c指南指出使用間接法建立參考區間必須采取必要的篩選措施以防醫院數據庫中大量非健康個體被納入[4]。GROSSI等[8]認為設置合適的篩選標準可以大幅提高數據的可靠性，如選擇排除過去3年內對同一項目進行過重復測試的個體數據、綜合觀察研究對象的相關性指標等。以γ-谷氨酰基轉移酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)為例，由于GGT與結合膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶存在相關性，排除3項指標中任意一項超過現行參考區間的個體有助于降低選中非健康個體的概率[8]。然而許多研究并未提及數據篩選標準的具體設置，迄今為止這種做法的必要性仍不明確。

在間接法建立參考區間的過程中，為了盡可能降低年齡和性別等因素對結果的影響，ARZIDEH等[5]還推薦使用者根據性別和年齡的差異對樣本進行分層篩選。

由于間接法建立生物參考區間需要使用相對較長時間范圍內的數據，因此分析變異、分析前因素等都有可能對結果造成影響，導致建立的生物參考區間受到影響。EP28-A3c指南認為堅持合格的質量控制程序可以將分析變異對結果造成的影響降至最低[3]。然而，受試者的狀態及是否空腹等一些分析前因素都會影響分析結果。這類因素所引起的變異很難被客觀評估，也很難被實際控制[4]，這在某種程度上也影響到間接法的可靠性。

一般來講，在間接法建立參考區間的過程中，足量的數據可以優化所建立的參考區間，其重要性甚至要高于統計方法的選擇。當然選擇正確的統計方法也能夠提高新建參考區間的準確度，尤其是在無法收集到足量數據的情況下[3]。

二、數據變換

由于間接法所使用的醫院數據中存在錯誤值的可能性較大，此類錯誤值(離群值)的存在會對最終獲取的生物參考區間造成影響，故應當予以剔除。然而許多離群值剔除方法是基于樣本數據呈正態分布的假設下建立的，當此類方法應用于偏態數據時，其可靠性將會下降。樣本數據呈正態分布是離群值剔除的基礎。HORN等[11]認為偏態數據會導致正常值被錯誤剔除或產生多個離群值的掩蓋效應，進而影響最終獲得的參考區間。因此，對于偏態分布的數據需要選用合適的方法預先對樣本數據進行變換，以使其達到正態或近似正態分布。

檢驗樣本數據是否呈正態分布的方法有很多，包括 Anderson-darling檢驗、Kolmogorov-Smirnov檢驗、Jarque-Bera檢驗以及 Skewness-Kurtosis檢驗(偏度-峰度檢驗)等。其中偏度-峰度檢驗應用較為簡便。標準正態分布數據的偏度和峰度值均為0，一般認為偏度或峰度的絕對值大于樣本標準差(s)的1.96倍，可以認為其分布與正態分布存在明顯差異[9]。GRECU 等[12]曾使用偏度-峰度檢驗來判定數據的正態性。上述幾種檢驗方法的共同特點是理論上適用于所有分布的擬合優度檢驗，并不針對某一特定的分布類型。然而在研究中還經常用到一些僅僅是針對一維正態分布數據而言的檢驗方法，其中常用的有比較直觀的Q-Q圖法，以Shapiro-Wilk檢驗為代表的回歸型檢驗和矩檢驗法等。

如果數據需要做正態性轉化，應當根據數據形態確定相應的轉換公式，其中最常見的情況為正偏態和陡峰態。然而并非所有形態的數據都可以通過此類轉換變為正態分布，如呈“雙峰”或“多峰”分布的數據，沒有任何公式可以將此類數據變換為單峰的正態分布。以下是兩類常見的數據變換方法。

1.指數及對數轉換 轉換公式見公式1～3。公式1多用于中度偏態數據，即偏度或峰度為s的2～3倍。公式2多用于高度偏態數據，即偏度或峰度為s的3倍以上。公式3糾偏力度最強，但有時會矯枉過正，容易將正偏態數據轉換成負偏態分布。公式中的x均代表待轉換變量。這3個公式的糾偏力度是遞增的。然而某些偏態分布的數據經平方根變換或對數變換后仍然呈偏態分布，尤其是負偏態數據經平方根變換或對數變換后反而會增加其偏性[13]。因而可能有必要尋找一種更全面的數據轉換方式。

2.Box-Cox轉換 Box-Cox轉換是基于統計分析中常用的一般線性模型假定:Y(λ)=Xβ+e，e～ N(0，σ2I);式中 Y(λ)為反應變量的向量，λ 為變換參數，X為設計矩陣或觀測矩陣，β為未知參數向量，e為誤差項，需要服從正態分布[14]。然而e通常不服從正態分布，不能直接用于數據分析。因此需要對變量Y進行Box-Cox變換，從而使e服從正態分布。Box-Cox變換自從1964年由Box和Cox提出后已成為一種常用的變換方法[15]。INAL等[9]在使用間接法建立促甲狀腺激素和游離甲狀腺素參考區間時使用了Box-Cox變換。ARAL等[16]在使用間接法建立凝血酶原時間和活化部分凝血活酶時間參考區間時也使用了Box-Cox變換。Box-Cox變換是針對變量Y進行變換。Y(Y＞0)的變換可以用公式4表示。公式4中的λ為待定變換參數。Box-Cox變換能對不同的λ做出不同的變換，所以它是一種涵蓋多種數據變換方式的模型，包括了對數變換、平方根變換和倒數變換等常用變換[14]。在變換過程中，通常采用極大似然法[17]來估計參數λ的值，而λ的值又是由所有樣本數據決定的。在實際應用中，經常通過Box-Cox變換來將偏態分布的數據變換為近似正態分布。然而并非任何分布類型的數據都可以通過Box-Cox變換達到正態分布[7]。Box-Cox變換過程中參數λ常取-5～5之間的值。若在此范圍中難以找到合適的λ值，一般不考慮使用Box-Cox變換。

三、離群值或錯誤值的剔除

由于間接法所使用的醫院數據中存在錯誤值的可能性較大，此類錯誤值(離群值)的存在會對最終獲取的生物參考區間造成影響，故應當予以剔除。

所謂離群值是指在數據中與其他數值相比差異較大的值。醫學實驗中經常出現存在離群值的情況，通常情況下很難準確判斷此類數據出現的具體原因。如果將正常值當做離群值剔除，那么必然導致最終獲取的參考區間反常縮小;反之，如果大量離群值存在于分析數據中，而相應的離群值剔除手段又沒有奏效，必然會引起參考區間的反常擴大[3]。在使用間接法建立生物參考區間的過程中，必須盡力避免這2種情況的出現。由于離群值剔除的方法較多，難以一一詳述。近年來的文獻主要介紹了以下幾種常用的離群值剔除方法。

1.箱式圖與莖葉圖法 箱式圖與莖葉圖法是基于四分位間距(inter-quartile range，IQR)的一種剔除離群值的方法。該法主要從數據兩側剔除3倍以上的IQR數據。箱式圖與莖葉圖法可以借助SPSS統計軟件輕松實現。軟件會計算IQR并自動從兩側剔除3倍以上的IQR數據。這套程序將重復執行直到所有離群值被剔除。如果數據事先經過正態性變換，則需要將數據變換回原先的形式[9]。箱式圖的優勢在于數據平均水平和變異程度可直觀分析比較。然而當離群點較多時，通過箱式圖判定離群值會變得困難，而莖葉圖則是更好的選擇。

2.狄克遜(Dixon)檢驗法 狄克遜檢驗法最早由Dixon在1953年提出。AITKENHEAD等[18]在使用間接法建立與兒童年齡相關的參考區間的相關研究中采用狄克遜檢驗法作為離群值的剔除方法。在 EP28-A3c指南中，狄克遜檢驗法被CLSI推薦作為離群值的剔除方法。狄克遜檢驗法的具體方法如下:定義R為極差(當前所有值中最大值和最小值之差)，D為可疑值與下一個最值之間差值的絕對值。如果D/R＞1/3，那該值便作為離群值被剔除。但EP28-A3c指南同時指出如果數據同側同時存在幾個相近的異常值時，狄克遜檢驗法便會因為其互相掩蓋而失去效果。當這種情況發生時，實驗者需要對離差最小的異常值使用狄克遜檢驗法進行計算，以保證所有異常值都能被剔除[3]。然而，在 EP28-A3c指南中并未說明使用狄克遜檢驗法時離差最小的異常值的確定方法[11]。

3.杜奇(Tukey)法 杜奇法是 TUKEY[19]在1977年Exploratory Data Analysis一書中首次提出的一種方法。它僅僅使用樣本數據中心50%的部分，以此來降低或限制單側多個相似離群值同時存在而產生的掩蓋效應。這種方法需要計算出數據分布的25%和75%百分位點的值(P25，P75)以及IQR，然后計算出上、下2個離群值決定水平:決定上限=P75+1.5×IQR;決定下限=P25-1.5×IQR。任何超出該范圍的數據均應被視為離群值。當已發現的離群值被剔除后，應當繼續并循環使用本方法直到剔除所有離群值為止[3]。和很多方法一樣，杜奇法的使用條件也是樣本數據呈正態分布。因此，在數據不呈正態分布的情況下必須對數據進行轉化。

4.格拉布斯檢驗法和肖維納準則(Grubbs method＆Chauvenet criteria) 在一組測量數據中，如果個別數據偏離平均值很遠，那么這些數據可以被稱作“可疑值”。我們可以使用格拉布斯檢驗法來判斷此類可疑值是否存在。若將“可疑值”從此組數據中剔除而不參與平均值的運算，那么該“可疑值”就被稱作“異常值”(粗大誤差)。格拉布斯檢驗法認為若某測量值(x)對應的殘差的絕對值(V)大于均值與s的乘積時應將該數據舍去，見公式 5[20]。KATAYEV 等[21]在使用間接法建立紅細胞平均體積、血紅蛋白濃度、肌酐、鈣、促甲狀腺激素的生物參考區間的研究中使用了肖維納準則剔除離群值。肖維納準則認為在n個測量值中任一數據與平均值的偏差大到這樣程度:凡等于或大于此偏差出現的概率均小于1/2n時(n為樣本例數且n≥4)，此數據應舍棄。簡而言之，即從概率意義上講，對于那些誤差的可能出現次數小于半次的相應測量值應予以剔除，據此可以得到可舍棄測量值的誤差標準，見公式6[20]。格拉布斯檢驗法是被理論和實驗所證明的一種較好的方法。1982年徐中秀在《異常值的處理方法分析及其應用》中曾使用大量模擬數據進行測試，認為相對于肖維納準則而言，格拉布斯檢驗法剔除效能更佳[22]。然而，格拉布斯檢驗法更適用于小樣本量的情況;肖維納準則用于n≥10的測量中較為合理、可靠，所以通常用于樣本量較大的情況下。肖維納準則的最大缺點在于其檢驗系數缺乏明確的意義[23]。格拉布斯檢驗法和肖維納準則的使用都需要分析數據呈正態分布。

式中u為積分變量，可通過查表得知;σ為樣本數據的s。

四、生物參考區間的建立方法

1.參數法(parametric method) 參數法估計生物參考區間是指將樣本數據與標準誤結合起來，確定一個具有較大置信度的包含總體參數的可信區間(confidence interval，CI)。CI由上、下2個可信限(confidence limit，CL)構成。在醫學研究中，最常用的置信度為95%[24]。參數法作為估計生物參考區間的經典方法被廣泛使用，其具體步驟無需贅述。值得注意的是參數法的使用前提為數據呈正態分布。如果樣本數據呈非正態分布，需要選擇一種合適的方法對數據進行處理[3]。

2.非參數法(nonparametric method)EP28-A3c指南明確指出非參數法是建立生物參考區間的推薦方法之一。由于參數法的計量水準明顯高于非參數法，因此非參數法對樣本數量的要求相對較高。根據REED等的建議，使用非參數法進行參考區間研究，最小的可靠觀測量為120例。在某些群體中，在某些組別的參考個體(如新生兒、兒童、老年人)不易獲得的情況下，收集120例或許會有困難。如果可能的話，允許研究年齡相仿的足夠的參考個體。無論獲得多大量的參考值，數據仍然應該根據非參數方法分析并根據適當的百分位數報告[3]。對大部分分析物而言，應該選取數據分布的2.5%和97.5%百分位值作為上、下參考限的取值[3]。然而對部分特殊分析物則應當區別對待。以心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)為例，2000年和2007年的對急性心肌梗死重新定義的文件指出cTn臨床判斷值應取表面健康人群參考區間上限的99%百分位值[25-26]。因此使用非參數法建立cTn應選取數據分布的99%百分位值作為參考限。有學者指出使用非參數法對已剔除離群值的數據建立生物參考區間時或許應當對用于計算上、下參考限的2個百分位點作適當調整。以杜奇法為例:從理論的角度來看，標準正態分布的上、下四分位數分別為 ±0.674 5，因此 IQR 為1.349。而杜奇法的上、下決定限分別為 -0.674 5-1.5×1.349 和0.674 5+1.5×1.349，即 ±2.698。因此，理論上來說只有＞2.698s的數據才能被認為是離群值。換言之，標準正態分布的數據中將有0.7%的數據被認為是離群值而被剔除。因此參考區間必須被增寬。例如如果要計算90%CI的參考區間，那么90%應被調整為90.634%;對于95%CI的參考區間，應當使用 95.67%[11]。

3.羅伯斯特(Robust)法 1998年，HORN等在“A robustapproach to reference interval estimation and evaluation”一文中對羅伯斯特法進行了詳盡的闡述。羅伯斯特法是一種介于參數法與非參數法之間的方法[26]，具有類似參數估計的過程并且對樣本量沒有太高的要求。因為離群值或錯誤值對該方法的影響較其他方法小，所以該法對于數據形態的要求不如其他的方法嚴格。正是由于這種特性使羅伯斯特法在非正態分布的數據中同樣表現出色[3]。從嚴格意義上來說，羅伯斯特法是一種小樣本估計參考區間的方法，被廣泛應用于樣本量少于120例的情況中。曾有學者對多種小樣本估計參考區間的方法進行比較，最終結果顯示羅伯斯特法在95%CI下對參考上限的估計遠優于其他方法[27]。雖然羅伯斯特法對于偏態數據同樣適用，但是它卻對數據的對稱性異常敏感，因此使用前必須仔細檢查數據的形態，確保樣本數據呈對稱分布。

4.其他方法 近幾年來出現了很多將計算機技術整合到間接法建立生物參考區間的嘗試。“Reference Value Advisor”是為了方便使用計算機建立生物參考區間，基于Microsoft Excel軟件設計的一組免費宏命令插件。Reference Value Advisor是根據EP28-A3c指南中所推薦的方法而設計的一款軟件，目前暫時只支持Microsoft Excel 2003及以上的版本。Reference Value Advisor V2.0目前可以在“http://www.biostat.envt.fr/”免費下載[7]。

五、總結

1.現狀 如今參考區間的使用現狀不容樂觀。很多醫學實驗室更傾向于沿用文獻或試劑廠商提供的參考區間，并未考慮到這些參考區間的可轉化性或這些參考區間本身就是錯誤的。由于間接法建立生物參考區間具備獨特優勢，在未來的臨床工作中也可能具備較好的應用前景[8]。然而使用間接法建立生物參考區間目前仍然存在爭議[9]，其最主要的原因是間接法所使用的數據包含錯誤值的可能性較大。EP28-A3c指南認為間接法只能對參考區間作出粗略的估計，在條件允許的情況下，仍然首先推薦使用直接法建立生物參考區間[3]。可以這么說，雖然使用間接法建立的生物參考區間和直接法所得到的結果相比可能存在一定偏差，但這比直接采納廠商提供的參考區間要好得多。另外在利用直接法建立參考區間的過程中，有時會面對部分特殊人群，如新生兒、兒童和老人等，一般很難從此類人群中收集合格且足量的參考個體。樣本量的不足將導致參考限的擴大，然而間接法無疑為此類較難研究的人群建立參考區間提供了一種新的機制[10]。

2.展望 利用醫院數據使用間接法建立生物參考區間并應用于臨床至少在理論上是可行的，但首先必須要確保數據來源的可靠性;其次需根據不同方法的具體要求以及數據分布，運用適當的方法對數據加以處理;第三則是使用恰當的方法剔除數據中存在的錯誤值或是直接將所需值分離。這一步恰恰是間接法的難點所在。如何根據不同項目和不同數據類型選擇最合適的方法及最合適的數據量尚無定論。目前很難單獨評判每種方法的優劣，只能根據數據量及數據分布并結合每種方法的特點選擇一種或多種較為合適的方法來使用。第四是利用預處理的數據選擇合適的方法建立參考區間。未來的挑戰是如何基于EP28-A3c指南繼續完善間接法建立參考區間的相關理論，并將間接法建立生物參考區間更多地運用到日常的臨床工作中。

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