MiRNA-122對5-氟尿嘧啶誘導BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響

虞 佳,唐正午,楊曉燕,殷 杰,向 瓊,雷小勇*

(1.南華大學藥物藥理研究所,湖南衡陽421001;2.南華大學附屬第一醫院骨科)

MiRNA-122對5-氟尿嘧啶誘導BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響

虞 佳1,唐正午2,楊曉燕1,殷 杰1,向 瓊1,雷小勇1*

(1.南華大學藥物藥理研究所,湖南衡陽421001;2.南華大學附屬第一醫院骨科)

目的 探討微水RNA-122(miR-122)對5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響。 方法構建miR-122和陰性對照質粒瞬時轉染至BEL-7402/5-FU細胞;流式細胞術檢測細胞凋亡情況;Western blot檢測caspase-8,caspase-9和caspase-3蛋白表達水平。 結果 僅用miR-122處理BEL-7402/5-FU細胞時,與未轉染組和轉染對照組比較,miRNA-122轉染組細胞凋亡率增加,用10μmol/mL 5-FU作用BEL-7402/5-FU細胞24 h后,與未轉染組和轉染對照組比較,miR-122轉染組細胞凋亡率明顯增加;與未轉染組和轉染對照組比較,轉染了miRNA-122的BEL-7402/5-FU細胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前體蛋白表達降低,活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表達升高。結論 miR-122能夠下調BEL-7402/5-FU細胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前體蛋白表達,上調活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表達,miR-122能促進5-FU誘導的BEL-7402/5-FU細胞凋亡。

微小RNA-122; BEL-7402/5-FU; 5-氟尿嘧啶; 細胞凋亡

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發生演化是一個多基因、多階段的過程[1],發病機制仍不完全清楚。目前,化療是治療肝癌重要手段之一。5-氟尿嘧啶(5-FU)作為抗代謝性腫瘤藥物,通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,抑制DNA的生物合成而殺死腫瘤細胞[2]。然而,氟尿嘧啶類抗癌藥耐藥性問題是肝癌化療中的關鍵障礙,其耐藥機制包括增加了胸腺嘧啶核苷酸合成酶和多藥耐藥相關蛋白的表達等[3],因此基因治療與化學藥物相結合將為原發性肝癌的治療開辟新的前景。

MiR-122是肝臟中特異高表達的miRNA,近來的研究結果提示,miR-122表達下調是在肝癌發生過程中伴隨發生的事件,它也可能是肝癌的一個潛在的生物標志[4]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族是哺乳動物細胞凋亡中的起始者和執行者。在正常細胞內,每一種caspase都以無活性的前體形式存在,死亡信號首先活化不同的caspase起始因子,再由起始因子激活下游的caspase效應分子,最終由效應分子特異地水解細胞中的一系列底物而導致細胞解體[5]。近年來研究表明,caspase-8、caspase-9和caspase-3表達水平與腫瘤發生、分化和發展有密切關系[6-8],caspase前體的活化在腫瘤化療藥物耐藥中具有重要作用和應用潛能。本文通過觀察miRNA-122對5-FU誘導BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響,以期能為逆轉肝癌耐藥提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BEL-7402/5-FU細胞購于南京凱基生物發展有限公司,1640粉末培養基購于美國GIBCO公司,線性化PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表達載體攜有熒光報告基因購于上海吉瑪公司,Lipofectamin 2000購于Invitrogen公司,5-氟尿嘧啶為天津金耀氨基酸有限公司,小鼠抗人 caspase-8一抗、小鼠抗人caspase-9一抗和兔抗人caspase-3一抗購于Cell singaling公司。倒置熒光顯微鏡(日本 Olympus公司),流式細胞儀(FCM)(德國Beckman公司)。

1.2 細胞培養

常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中,置于37℃,5%二氧化碳培養箱,在BEL-7402/5-FU細胞培養液加入0.15μmol/mL 5-FU維持耐藥性培養。細胞經傳代和收集,取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 載體構建和轉染

1.3.1 質粒表達載體構建 將Pre-miR-122(TM)(miR-122)片段插入載體序列并進行測序。PremiR-122(TM)轉染進入細胞經加工形成成熟miR-122。將與人源miRNA無同源性的線蟲miR-67插入載體序列,作為陰性對照。

1.3.2 質粒提取與細胞轉染 將已構建好的miR-122質粒表達載體和miRNA陰性對照表達載體(載體上含大觀霉素耐藥基因),轉化進入JM109菌株進行擴增,質粒提取試劑盒提取質粒,-20℃保存備用。細胞轉染按脂質體Lipofectamine 2000說明書進行,取對數生長期細胞接種于6孔板,每孔1.0×105個細胞,細胞生長至占培養孔80～85%時進行轉染。轉染48小時后,倒置熒光顯微鏡觀察轉染率,取細胞進行實驗。

1.3.3 Q-RT-PCR檢測細胞中miR-122表達水平采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,逆轉錄實驗流程按RT-PCR試劑盒說明書進行。

1.4 流式細胞術檢測

將BEL-7402/5-FU細胞(未轉染組)、轉染對照組細胞以及miR-122轉染組細胞分別用0和10μmol/mL 5-FU處理24小時,將所有細胞收集于1.5 mL離心管中,PBS緩沖液洗滌細胞,加70%乙醇1 mL在4℃固定過夜。離心去上層液,PBS緩沖液洗一遍,加200μL RNA酶消化細胞,37℃孵育30分鐘。加PI 800μL印跡細胞,室溫孵育30分鐘,流式細胞儀檢測。

1.5 Western blot檢測細胞蛋白的水平

待各組細胞完全長滿75 mL培養瓶時,棄去培養基,PBS洗滌3次,晾干后加入細胞裂解液90μL裂解,并加入蛋白酶抑制劑10μL,置冰上10分鐘讓其充分裂解,細胞刮子收集細胞,超聲進一步裂解,4℃離心13 000 rpm18分鐘,吸取上清液,紫外分光光度計法進行蛋白定量,每組40μg蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳,轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1小時,1%脫脂牛奶稀釋孵育一抗4℃過夜(1∶500),稀釋孵育二抗37℃1小時(1∶1 000),暗室顯影。

1.6 統計處理

2 結 果

2.1 MiR-122聯合5-FU對BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響

僅用miR-122處理BEL-7402/5-FU細胞時,與未轉染組和轉染對照組比較,miRNA-122轉染組的凋亡率明顯增加(8.14±0.66%vs 1.24±0.45%,1.93±0.49%);用10μmol/ml 5-FU處理各組細胞24小時后,與未轉染組和轉染對照組比較,miR-122轉染組細胞凋亡率明顯增加(48.7±1.85%vs 22.5±0.91%,25.8±1.12%)(圖1),miR-122能促進5-FU誘導BEL-7402/5-FU細胞的凋亡。

圖1 miR-122聯合5-FU對BEL-7402/5-FU細胞凋亡的影響

2.2 MiR-122對BEL-7402/5-FU細胞中caspase-8、caspase-9、caspase-3蛋白表達的影響

與未轉染組和轉染對照組相比,轉染miR-122的BEL-7402/5-FU細胞中caspase-8前體蛋白表達降低,而活化的caspase-8蛋白表達增加(圖2)。轉染miR-122的BEL-7402/5-FU細胞中caspase-9前體蛋白表達降低,而活化的caspase-9蛋白表達增加(圖3)。轉染 miR-122的 BEL-7402/5-FU細胞中caspase-3前體蛋白表達降低,而活化的caspase-3蛋白表達增加(圖4)。

圖2 miR-122對BEL-7402/5-FU細胞caspase-8蛋白表達的影響

圖3 miR-122對BEL-7402/5-FU細胞caspase-9蛋白表達的影響

3 討 論

腫瘤細胞對抗癌藥物產生耐藥是腫瘤化療失敗的主要原因之一。在臨床應用中,多數患者經化療緩解后,腫瘤細胞對5-FU產生了耐藥,使得化療效果明顯降低。為逆轉5-FU的耐藥性,人們進行過廣泛的探討,但至今尚未發現一種在體內有良好逆轉5-FU耐藥性的藥物。有研究表明,耐藥株不出現凋亡增加及細胞周期改變;耐藥株凋亡相關因子表達也異于一般的腫瘤細胞。人肝癌BEL-7402/5-FU耐藥株的多藥耐藥性可能和凋亡減少有關[9]。

在細胞凋亡的過程中caspase家族起著關鍵性的作用,caspase可自我活化并能相互激活,凋亡過程一旦觸發,即呈級聯放大效應[10]。在凋亡執行階段由下游caspase對特定的底物進行切割,激活核行層蛋白、肌動蛋白等的蛋白酶及核酸內切酶等,抑制DNA修復酶從而破壞細胞骨架蛋白和核蛋白,使染色體斷裂成小片斷,這些不可逆轉的改變導致細胞凋亡。盡管半胱天冬酶不是參與凋亡的唯一酶系,但它們的作用是必需的。腫瘤細胞的生物學特性是異常增殖和永生化,常常表現為凋亡不足,怎樣通過激活caspase酶系統促進腫瘤細胞的凋亡是值得研究的問題。另外,caspase在腫瘤化療藥物的抗藥性中具有重要作用和應用潛能。在活細胞中caspase前體已經存在,但其只在發生細胞凋亡時才被快速活化,因而,以誘導凋亡為目標的腫瘤治療方法主要是通過各種因子對caspase前體進行活化而進行的。

越來越多的研究證實miRNA突變或者異常表達與多種人類癌癥發生相關,miRNA的表征有望成為腫瘤診斷和預后的生物學標記。此外,miRNA特異性調控靶基因的作用方式,可能為抗腫瘤治療提供新的方法[11]。因此,我們將研究目標鎖定在與化療耐藥相關的miRNA上,從新的層面來揭示化療耐藥的分子機制。前期研究發現,miR-122能降低抗凋亡基因家族成員 Bcl-xL、Bcl-2的 mRNA表達量[12-14]。本實驗結果也發現,miR-122瞬時轉染后,5-FU誘導細胞凋亡增加,提示miR-122能促進BEL-7402/5-FU細胞凋亡。Western blot檢測miR-122轉染后BEL-7402/5-FU細胞的caspases-8,caspases-9和caspases-3活化形式表達上調,提示miR-122可能通過靶向作用Bcl-2基因家族成員抗凋亡減少,激活細胞凋亡下游通路,促使caspase-8、caspases-9和caspases-3活化,從而引發caspases級聯放大效應,使得細胞凋亡增加。miR-122很可能是抗腫瘤治療的一個有效靶點,尤其是在針對腫瘤耐藥治療方面,能夠有效的逆轉肝癌細胞化療耐藥,促進癌細胞調亡,為肝癌的基因治療提供了新的思路。

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Effects of miRNA-122 on BEL-7402/5-FU cell apoptosis induced by 5-fluracil

YU Jia,TANG Zhengwu,YANG Xiaoyan,et al
(Institute of Pharmacy and Pharmacology,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective This study deals with the effects of miRNA-122 on BEL-7402/5-FU cell apoptosis induced by 5-fluracil. Method MiR-122 and control miRNA expression vectors were transient transfected into BEL-7402/5-FU cells.Cell apoptotic percentage was detected by flow cytometry.Western blot was used to detect the caspase-8,caspase-9 and caspase-3 protein expression. Result Flow cytometry results demonstrated that miR-122 transfected cells had a higher apoptosis rate than BEL-7402/5-FU cells or control group.Moreover,miR-122 transfected cells had significant move value than BEL-7402/5-FU cells or control group by 10μmol/ml 5-FU for 24 hours.Western bolt results showed that the expression level of pro-caspase-8,pro-caspase-9 and pro-caspase-3 in miR-122 transfected cells were obviously decreased,while the expression level of active caspase-8,caspase-9 and caspase-3 were obviously increased compared with BEL-7402/5-FU cells or control group. Conclusion miR-122 down-regulate pro-caspase-8,pro-caspase-9 and pro-caspase-3 expressions and up-regulate active caspase-8,caspase-9 and caspase-3 expressions in BEL-7402/5-FU cells.MiR-122 increased the cell apoptosis induced by 5-fluracil.

miR-122; BEL-7402/5-FU; 5-FU; cell apoptosis

R735.7

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.004

2014-11-26;

2015-2-17

湖南省教育廳一般課題(13C832).

*通訊作者,E-mail:lei_xiaoyong@aliyun.com.

(此文編輯:秦旭平)