饑餓誘導人胚腎細胞自噬模型的構建

黃楨鈞 劉慰華 鐘赟 劉少軍

基礎研究論著

饑餓誘導人胚腎細胞自噬模型的構建

黃楨鈞 劉慰華 鐘赟 劉少軍

目的探討饑餓誘導的人胚腎細胞（HEK293）自噬模型的構建。方法采用Earle's平衡鹽溶液（EBSS）分別處理HEK293細胞0、1、2、4、8 h，顯微鏡下觀察細胞形態變化，蛋白免疫印跡法檢測自噬微管相關蛋白輕鏈（LC）3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和p62的表達；雙熒光mRFP-eGFP-LC3（ptfLC3）質粒轉染HEK293細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察EBSS饑餓條件下細胞內紅色和綠色LC3熒光亮點的變化。結果饑餓處理后，HEK293細胞皺縮、變小變圓，蛋白免疫印跡法可檢測到LC3的蛋白表達和LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值增加；熒光顯微鏡可觀察到細胞內紅色和綠色LC3熒光亮點均增加。結論饑餓可成功誘導HEK293細胞自噬，表現為LC3蛋白表達和LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的增加，以及熒光顯微鏡下細胞內紅色和綠色LC3熒光亮點的增加。

饑餓；自噬；自噬微管相關蛋白輕鏈3；p62；雙熒光檢測

自噬是細胞內的一種蛋白降解途徑，即細胞中受損的蛋白質、細胞器被雙層膜結構包繞形成自噬體，與溶酶體結合后即可被降解［1］。自噬普遍存在于真核細胞內，無論是在生理過程還是在病理狀態下，均可見自噬現象。研究表明，自噬參與了神經退行性疾病、心臟疾病和惡性腫瘤等多種疾病的發生、發展［2-3］。當細胞缺乏營養即饑餓時可激活自噬，饑餓性自噬是最基本的自噬過程。本研究選用常用的工具細胞——人胚腎細胞（HEK293細胞），以Earle's平衡鹽溶液（EBSS）處理作為饑餓手段，建立HEK293細胞自噬模型，旨在為自噬的研究提供更具有普遍意義的方法學參考［4］。

材料與方法

一、細胞來源

HEK293細胞購自中國科學院細胞庫，采用含10%胎牛血清、1%鏈-青霉素的DMEM培養液，在37℃、5%CO2飽和濕度下培養，0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

二、主要試劑

DMEM培養液、EBSS購自美國Gibco公司，雷帕霉素購自上海生工生物工程股份有限公司，mRFP-eGFP-自噬微管相關蛋白輕鏈（LC）3質粒購自美國Addgene公司。LC3B兔抗人多克隆抗體購自美國Sigma公司，p62兔抗人多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，內參照物GAPDH鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔、羊抗小鼠IgG購自美國Cell Signaling公司。脂質體Lipofactamine 3000轉染試劑盒購自美國Life Technologies公司。

三、主要儀器

包括美國Thermo scientific 3110系列ⅡCO2培養箱，美國Thermo scientific 1300系列A2生物安全柜，美國AMG EVOS fl熒光顯微鏡，美國Thermo scientific BCA蛋白測定試劑盒，美國Biotek Epoch酶標儀，美國Bio-Rad電泳儀和轉膜儀。

四、方法

1.細胞形態變化的觀察

以EBSS代替DMEM培養液，饑餓處理HEK293細胞0、1、2、4、8 h，并與另一自噬誘導劑雷帕霉素（200 nmol／L）作陽性對照，使用高倍顯微鏡在400倍視野下觀察細胞的形態變化，并采集相應的圖片。

2.LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和p62蛋白表達水平檢測

采用蛋白免疫印跡法，按前述方法分組處理HEK293細胞，收集蛋白前用4℃預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，加RIPA蛋白裂解液冰上裂解5 min，超聲充分裂解細胞。調整蛋白濃度后行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，100 V恒壓轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗LC3（1∶2 000）、p62（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）4℃搖床孵育過夜。二抗室溫孵育1 h，電化學發光顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析灰度值，計算LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ。

3.自噬流的監測

對自噬流進行雙熒光mRFP-eGFP-LC3監測。采用mRFP-eGFP-LC3質粒瞬時轉染HEK293細胞，轉染24 h后分為未經處理的陰性對照組、EBSS饑餓處理組、雷帕霉素陽性對照組，分別處理2 h。由于eGFP綠色熒光和mRFP紅色熒光在自噬體同時存在，在紅、綠熒光合成圖像中呈黃色；但在自噬溶酶體酸性環境中eGFP綠色熒光降解，只剩下紅色熒光。因此可用合成圖像中的黃色斑點（自噬體）和紅色斑點（自噬溶酶體）較完整地反映細胞內自噬囊泡的數量［5］。分組處理細胞后在400倍熒光顯微鏡下觀察，隨機采集300個細胞內的紅、綠色LC3熒光圖，計數其合成圖像中平均每個細胞含有黃色亮點和紅色亮點的數量。

五、統計學處理

結 果

一、顯微鏡下HEK293細胞形態的變化

與對照組相比，EBSS饑餓處理1 h時，HEK293細胞形態即有明顯變化，細胞皺縮、變小變圓鈍，隨著饑餓時間延長，細胞形態變化越大；雷帕霉素處理未見明顯細胞形態變化，見圖1。

二、HEK293細胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和p62蛋白表達水平變化

與饑餓處理0 h組相比，饑餓處理1 h后LC3-Ⅱ表達及LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ均增加，2 h達到峰值，之后逐漸減少；饑餓未明顯誘導p62蛋白表達下降，見圖2。

三、饑餓處理對HEK293細胞自噬流的影響

經EBSS及雷帕霉素處理2 h后，紅、黃色熒光亮點數均比陰性對照組明顯增加（P＜0.05），提示自噬體和自噬溶酶體增加，說明饑餓處理使HEK293細胞中自噬流增加，見圖3。

討 論

自噬作為與溶酶體相關的主要蛋白降解途徑之一，影響著細胞的能量代謝。自噬產生的氨基酸、脂肪酸等降解產物可供細胞重新利用，因而適度的自噬水平有利于維持細胞能量代謝促使細胞存活；而自噬過度激活可能導致細胞發生自噬性死亡。自噬激活或缺陷在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用［6-7］。研究細胞自噬機制可為惡性腫瘤和神經退行性疾病等的治療提供新的途徑和作用靶點［8-10］。自噬是一個非常復雜、連續動態的過程，目前還沒有任何一種檢測方法能夠單獨反映整個自噬過程。現有檢測方式缺乏特異性。

圖1 饑餓處理后HEK293細胞的形態變化

圖2 饑餓處理后HEK293細胞內LC3和p62的蛋白表達水平變化

圖3 饑餓處理后HEK293細胞自噬流增加

電鏡下觀察到自噬結構是自噬存在最直接的證據，主要用于定性分析［11］。典型的自噬體為雙層膜結構，其內包含有如線粒體、內質網或高爾基體碎片等細胞器成分。但自噬體轉化為自噬溶酶體后則變為單層膜結構，其內容物也逐漸被降解，自噬囊泡的辨認難度加大。另外，細胞內的線粒體或包繞線粒體的粗面內質網等雙層膜結構，也易與真正的雙層膜自噬體結構混淆。盡管可以對樣品進行多次切片并測量自噬結構的橫截面積以期定量細胞自噬活性，但在細胞中鑒別出自噬體結構本身就已經相當困難，而且自噬結構在細胞內并非均勻分布，使這種定量方法很難準確反映細胞自噬水平。

免疫金電鏡技術是相對可行的定量方法，用膠體金顆粒標記異噬體和兩性體內的異噬內容物，或者標記自噬前體和自噬體膜上的LC3，從而把自噬前體、自噬體和自噬溶酶體鑒別開來。需要注意的是，這種定量方法也只能反映靜態自噬水平，不能反映自噬流的變化。另外，丹酰戊二胺染色、吖啶橙染色等方法也可以用于標記自噬囊泡，但因特異性較差，應用價值有限。

蛋白免疫印跡法檢測LC3蛋白表達水平及LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值變化是簡便可行的方法。LC3是酵母ATG在哺乳動物中的同源物，是目前最可靠的自噬標記蛋白。正常情況下，LC3-Ⅰ分布在細胞質中，與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ后即轉移到自噬體的內外膜上，并貫穿于整個自噬過程。電鏡和GFP-LC3轉染實驗證實，LC3-Ⅱ含量增加能夠反映細胞內自噬囊泡的增加。另外，多種細胞尤其是腫瘤細胞存在一定水平的基礎自噬，在細胞狀態不同時LC3-Ⅱ含量也可能發生明顯變化。因此，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值是反映自噬水平的可靠指標。本研究以EBSS制造細胞饑餓環境，LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的增加均在2 h達到峰值。p62／SQSTM1是一種自噬降解底物，屬于泛素樣結合蛋白，與LC3偶聯參與自噬體的形成，在自噬中晚期被降解。自噬激活時細胞內p62可減少，然而這種減少在很多情況下較難觀察到［12］。

以GFP-LC3融合蛋白的質粒轉染細胞后，熒光顯微鏡下可觀察到LC3-Ⅰ呈綠色熒光彌散分布于細胞質中，而LC3-Ⅱ大量聚集在自噬體膜上，呈綠色亮點，或者稱為GFP-LC3亮點，亮點可用來反映自噬體的數目。這是目前應用比較廣泛的自噬定量方法。但由于GFP綠色熒光在自噬溶酶體內酸性條件下易降解，GFP-LC3不能完全反映自噬結構。Kimura等［5］根據RFP紅色熒光不易在溶酶體內降解這一原理，使用mRFP-eGFP-LC3轉染細胞，證實紅色熒光和綠色熒光在自噬前體和自噬體共表達，呈黃色；而當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，GFP綠色熒光消失，只剩下紅色熒光。因此可以通過統計合成圖像中平均每個細胞含有的黃色和紅色亮點代表自噬體和自噬溶酶體的數量，這比單純GFP-LC3法更全面地反映自噬活性和自噬通量的變化。因此，本研究采用mRFP-eGFP-LC3替代GFP-LC3觀察LC3亮點。

本研究建立了一個簡便而實用的細胞自噬模型，為進一步研究細胞自噬本身的分子機制以及自噬在腫瘤等方面的作用提供了可靠的實驗對象。由于雙熒光mRFP-eGFP-LC3法還未在多種類型的細胞中應用，因而還需要進行更多的實驗建立更可靠、合理的實驗標準。

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Establishment of HEK293 cell line with starvation-induced autophagy

Huang Zhenjun，Liu Weihua，Zhong Yun，Liu Shaojun.Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease／Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

ObjectiveTo establish HEK293 cell model with starvation-induced autophagy.MethodsHEK293 cells were treated with Earle's balanced salt solution（EBSS）for 0，1，2，4 and 8 h.Then the changes in cell morphology were observed under a microscope.And the expression levels of two autophagy-related proteins including LC3 and p62 were detected by western blotting.After transfected with plasmids encoding mRFP-eGFP tandem fluorescent-tagged LC3（ptfLC3）for 24 h，the changes in LC3 puncta labeled with red and green fluorescence were observed under fluorescence microscopy when HEK293 cells were starved in EBSS.ResultsHEK293 cells shrank obviously and became smaller and round after starvation.The expression of LC3 protein and the ratio of LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰwere increased detected by western blotting.The number of LC3 puncta labeled with red and green fluorescence was elevated under fluorescence microscopy.ConclusionsAutophagy in HEK293 cells can be successfully induced by starvation，manifested as increased expression of LC3 protein and enhanced ratio of LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰand elevated number of LC3 puncta labeled with red and green fluorescence.

Starvation；Autophagy；LC3；p62；mRFP-eGFP

2014-12-20）

（本文編輯：林燕薇）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.004

510260廣州，廣州心血管疾病研究所廣州醫科大學附屬第二醫院心內科［黃楨鈞（碩士研究生），劉慰華，鐘赟，劉少軍］

，劉少軍，E-mail：shaojunliu＠yahoo.com